□ 李 琳 廈門斯坦道科學(xué)儀器股份有限公司

過氧化氫，俗稱雙氧水，它無色、無味，具有高效殺菌、漂白與防腐的作用，常作為添加劑廣泛用于各種食品加工過程中。GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，過氧化氫被歸為加工助劑，但標(biāo)準(zhǔn)要求制成成品前要完全除去或盡量降低殘留量，不可對(duì)健康產(chǎn)生危害。國內(nèi)外研究表明，過氫化氫進(jìn)入人體后可能加速人體的衰老或誘發(fā)心血管疾病等[1]。雖然國家對(duì)食品安全加強(qiáng)了監(jiān)管，但過氧化氫在食品中的濫用現(xiàn)象仍然存在。因此，市場上急需一種能快速檢測(cè)食品中過氧化氫殘留的產(chǎn)品，以保障消費(fèi)者安全，減少疾病的發(fā)生。

現(xiàn)行檢測(cè)食品中過氧化氫殘留檢測(cè)方法主要包括化學(xué)分析法和儀器分析法，目前國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法也是碘量法和鈦鹽比色法。這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作繁瑣，難以應(yīng)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行快速批量的現(xiàn)場檢測(cè)。試紙法具有操作簡單、攜帶方便、耗時(shí)短與價(jià)格低廉等特點(diǎn)，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)。謝莉等[2]利用酶促顯色反應(yīng)原理制作檢測(cè)試紙檢測(cè)過氧化氫殘留，但試紙的有效期在6個(gè)月左右，不利于實(shí)際流通使用。本試驗(yàn)也是利用酶促顯色反應(yīng)原理，優(yōu)化試紙配方含量以及制作工藝，提高檢測(cè)的靈敏度，在食品安全快速檢測(cè)中具有較強(qiáng)的市場競爭力。

1 材料與試劑

辣根過氧化物酶（HRP）、3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、牛血清白蛋白（BSA），購自麥克林生化科技有限公司，檸檬酸三鈉、檸檬酸、抗壞血酸、蔗糖、聚乙二醇、硫代硫酸鈉、無水乙醇、30%過氧化氫均購自西隴化工股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試紙顯色條件優(yōu)化

2.1.1 顯色液A中HRP含量優(yōu)化

HRP是顯色反應(yīng)中的催化劑，它的含量決定了顯色差異。綜合考慮顯色情況、顯色時(shí)間和試紙本底背景以及HRP價(jià)格成本等因素，確定HRP的最優(yōu)添加含量為650 mg/L。由于pH對(duì)酶活性反應(yīng)的影響較大，本試驗(yàn)中選用了檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH5.0）作為反應(yīng)底液。

2.1.2 顯色液B中TMB含量優(yōu)化

TMB為催化反應(yīng)底物，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TMB含量為2 g/L時(shí)，顯色速度快，顯色差異明顯，當(dāng)TMB含量大于2 g/L時(shí)，試紙本底顏色發(fā)黃，且穩(wěn)定性差，不利于后期試紙的保存。

2.1.3 顯色液中酶的保護(hù)劑含量優(yōu)化

辣根過氧化物酶在低濃度下容易失去活性，所以為了延長試紙的保存期限，需要在顯色液中加入合適的酶保護(hù)劑。優(yōu)化選擇蔗糖、聚乙二醇、BSA組成酶保護(hù)體系，綜合考慮試紙狀態(tài)等，確定了蔗糖濃度為25 g/L，聚乙二醇濃度為10 g/L，BSA濃度為5 g/L。

2.1.4 顯色液中TMB的抗氧化劑含量優(yōu)化

由于TMB容易被氧化，在顯色液中加入適量抗氧化劑可以提高TMB穩(wěn)定性，優(yōu)化選擇以抗壞血酸和硫代硫酸鈉組成抗氧化體系，添加了酶保護(hù)試劑和抗氧化劑配方的試紙，室溫密閉條件下的保質(zhì)期可以達(dá)到12個(gè)月，易于推廣使用。

2.2 試紙制作工藝的確定

2.2.1 制作試紙的選型

濾紙的種類有很多，但是不同的濾紙的檢測(cè)效果差異較大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，最終選擇了Waterman 3M濾紙作為檢測(cè)試紙材料。

2.2.2 浸泡與烘干時(shí)間優(yōu)化

試紙制作也是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在制作流程中，最關(guān)鍵的3個(gè)因素是浸泡時(shí)間、烘干時(shí)間以及烘干溫度。綜合考慮制作效率和可操作性等因素，最終選擇了在顯色液中浸泡20 s，恒溫真空干燥箱40 ℃烘干20 min的工藝為最優(yōu)方案。

2.3 檢測(cè)試紙性能試驗(yàn)

2.3.1 快速半定量檢測(cè)試驗(yàn)

以最優(yōu)配方以及制作工藝制備快速檢測(cè)試紙，在試紙上分別滴加不同濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，并制備標(biāo)準(zhǔn)色卡，則可通過比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)色卡，快速了解食品樣品中過氧化氫的濃度。

2.3.2 試紙檢測(cè)限

以最優(yōu)方案制作的試紙，用過氧化氫雙氧水標(biāo)準(zhǔn)品來測(cè)試試紙最低檢出限，當(dāng)濃度低于0.6 mg/L時(shí)，試紙顯色較淺，需借助空白試紙才可以目視辨認(rèn)。所以，最終確認(rèn)檢測(cè)試紙的檢出限為0.6 mg/L。

2.3.3 試紙穩(wěn)定性

取試紙成品10份，置于室溫桌面上平放，另取同批次試紙成品10份，置于密封袋中并于桌面上平放，8 h后，敞開放置于桌面上的試紙本底顏色由白色變?yōu)榈G色，而密封袋中的試紙本底仍為白色，所以建議該檢測(cè)試紙密封干燥保存。

2.3.4 試紙保質(zhì)期

為了延長試紙保質(zhì)期，本實(shí)驗(yàn)顯色液配方中加入了酶保護(hù)劑以及抗氧化劑，一定程度上增加了試紙的穩(wěn)定性，經(jīng)過長期試驗(yàn)跟蹤測(cè)試，發(fā)現(xiàn)密封干燥條件下，檢測(cè)試紙可以保存12個(gè)月。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要針對(duì)食品加工助劑過氧化氫殘留問題，根據(jù)酶促反應(yīng)顯色原理，通過在顯色液中添加酶保護(hù)劑和抗氧化劑研制出了快速檢測(cè)試紙，并優(yōu)化了試紙的制作工藝條件，確定了最佳方案。制作的過氧化氫檢測(cè)試紙的最低檢出限為0.6 mg/L，試紙保質(zhì)期為12個(gè)月。該試紙具有攜帶方便、簡單易用、無需專業(yè)培訓(xùn)與價(jià)格低廉等特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場食品安全快速檢測(cè)，易于推廣使用。