林曉婷，王秋紅，匡海學(xué)

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150000；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州510405）

麻黃為麻黃科植物草麻黃（Ephedra sinicaStapf）、中麻黃（Ephedra intermediaSchrenk et C.A.Mey.）或木賊麻黃（Ephedra equisetinaBge.）的干燥草質(zhì)莖，為《中國(guó)藥典》2020版一部收載品種，功能主治發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫等[1]。其中的多糖組分已被證實(shí)具有明顯的免疫抑制作用[2-4]，針對(duì)小鼠碳廓清、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、小鼠溶血素和小鼠脾細(xì)胞增殖等體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)均有明顯效果。麻黃總多糖也為治療哮喘藥物麻黃多糖片劑的原料藥。對(duì)于多糖組成的HPLC研究檢測(cè)方法柱前衍生也已經(jīng)相當(dāng)成熟[5-9]。經(jīng)毛細(xì)管電泳，HPLC等方法[10-12]確定甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖9種單糖共同組成麻黃多糖。

本實(shí)驗(yàn)利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）對(duì)其中單糖醛基進(jìn)行定量衍生反應(yīng)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索與討論總結(jié)，發(fā)現(xiàn)最終實(shí)驗(yàn)條件下衍生物無(wú)異構(gòu)體產(chǎn)生，且可通過(guò)HPLC法對(duì)麻黃粗多糖中4種含量較多的單糖進(jìn)行測(cè)定。故此方法準(zhǔn)確率高，精密度良好，適用于多糖中單糖含量的精密測(cè)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Alliance HPLC色譜儀，包括2695四元泵、2998紫外檢測(cè)器，SB-5200D型超聲波清洗器（寧波實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；梅特勒AL204、AB265-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo Group公司）；Milli-Q純水器（密理博上海貿(mào)易有限公司）；EYELA OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)原料購(gòu)于安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室蘇連杰教授鑒定為麻黃科植物草麻黃（Ephedra sinica Stapf）的干燥草質(zhì)莖；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon,PMP,北京化學(xué)試劑公司）；單糖對(duì)照品:甘露糖（Man）,核糖（Rib），鼠李糖（Rha）,葡萄糖醛酸（GlcUA）,半乳糖醛酸（GalUA）,葡萄糖（Glc）,半乳糖（Gal）,木糖（Xyl）,阿拉伯糖（Ara）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，純度均大于99%。

三氟乙酸（AR天津市福晨化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Dikama公司）；Na2HPO4（AR天津市天力化學(xué)試劑有限公司）;NaH2PO4（AR天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃多糖的提取

參考本課題組前期麻黃總多糖提取條件[10-14]，并優(yōu)化。取麻黃干燥草質(zhì)莖100g，精密稱定，加80%乙醇溶液7倍量，回流提取3h，過(guò)濾，加14倍量水，加熱回流提取3次,每次3h，所得藥液濃縮至料液比1∶1，加入乙醇至醇體積分?jǐn)?shù)為80%，常溫下靜置36h，回收沉淀，80℃下烘干，既得麻黃總多糖產(chǎn)物。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供使品溶液

游離供使品溶液 取麻黃總多糖10mg，精密稱定，加入3.0mL蒸餾水中，搖勻使其全部溶解，既得。

水解供使品溶液 取麻黃總多糖10mg，精密稱定,置于安瓿瓶中，加入2mol·L-1的三氟乙酸溶液2.0mL，在瓶中充滿N2封口，110℃下水解3h，將反應(yīng)后溶液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，甲醇反復(fù)減壓濃縮至無(wú)酸味。精密加入3.0mL超純水溶解殘?jiān)鹊谩?/p>

2.2.2 對(duì)照品溶液 分別取9種單糖（甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖）的對(duì)照品適量，精密稱定，置于10mL容量瓶中用水溶解至刻度，搖勻，配置成每1mL含1mmol或2mmol的混合對(duì)照品溶液，并且同時(shí)分別用相同方法配置各單糖的單獨(dú)對(duì)照品溶液，備用。

2.3 衍生化產(chǎn)物的制備

將單糖對(duì)照品、混合對(duì)照品、麻黃總糖游離糖樣品溶液和麻黃總糖水解樣品溶液各取100μL分別置于10mL塑料離心管中，依次加入0.3mol·L-1NaOH溶液100μL和0.5mol·L-1的PMP甲醇溶液200μL，用0.3mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至7～8之間,混勻。置于70℃水浴中反應(yīng)30min左右。取出室溫下放置10min,加入與上述NaOH溶液等體積的0.3mol·L-1HCl溶液，震蕩混勻，再向其中加入12.5%的磷酸鹽緩沖液使其定容至1mL。加入5mL氯仿，震蕩渦旋30s，5000r·min-1離心5min，取上層溶液，12000r·min-1再次離心5min，取出上清，過(guò)0.45μm濾膜，既得[4-8]。

2.4 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250×4.6mm，5μm），流速：0.8mL·min-1，流動(dòng)相：100mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為6.8）（A）-乙腈（B）；等度洗脫：A:84%，B:16%。柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：245μm。

圖1 對(duì)照品（A）與樣品（B）衍生物色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards（A）and sample precolumn derivation products（B）

2.5 不同批次的麻黃總糖水解液和水溶液測(cè)定結(jié)果

取不同8批次制備的麻黃粗多糖，分別按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行供使品溶液的制備，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 不同批次麻黃粗多糖中4種單糖含量Tab.1 Contents of saccharine in the total Exphedra saccharide from different batches

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系

分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2，4，6，8，10mL置10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系列對(duì)照品混合溶液。在“2.4”項(xiàng)色譜色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積的響應(yīng)值，以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表2 4種單糖衍生物的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationship for precolumn derivation product of four monsaccharide

表2 結(jié)果表明，在線性濃度范圍內(nèi)，濃度和峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取混合單糖衍生對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行衍生，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得日內(nèi)4種單糖的保留時(shí)間和峰面積RSD均小于2%，作為日內(nèi)精密度。連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)樣4次，測(cè)得4種單糖的日間保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，作為日間精密度。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批麻黃總糖（批號(hào)20160401）樣品水解液，按照“2.3”項(xiàng)下平行制備6份，分別在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)得麻黃總糖樣品中4種單糖的RSD均小于3%，證明此方法重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供使品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下精密測(cè)定，0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣后的峰面積。結(jié)果峰面積的RSD均小于3%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取含有量已知麻黃總糖（批號(hào)20160401）供使品10mg，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，取水解復(fù)溶后溶液50μL 9份，分別置于9個(gè)10mL塑料離心管中，向其中分別加入低、中、高不同量的4種單糖混合對(duì)照品溶液50μL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，每個(gè)濃度平行制備3份，進(jìn)行HPLC分析，記錄各單糖峰面積的響應(yīng)值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供使品中糖含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3，回收率均在98%～102%之間，表明此方法測(cè)定準(zhǔn)確。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of recovery tests（n=3）

4 討論

4.1 色譜條件

分別考察了100mmol·L-1磷酸緩沖鹽-乙腈和50mmol磷酸緩沖鹽-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)等度洗脫和梯度洗脫，流速0.6、0.8、1mL·min-1等條件下，色譜峰的分離度情況，其中鼠李糖與核糖，木糖和阿拉伯糖的峰難于分離。經(jīng)綜合考察在以100mmol·L-1磷酸緩沖鹽為流動(dòng)相時(shí)，9種單糖的分離度最好。流速在0.8mL·min-1時(shí)，機(jī)器狀態(tài)最佳，半乳糖，木糖，阿拉伯糖3種單糖恰好分開。且磷酸鹽緩沖液要現(xiàn)用現(xiàn)配，不用時(shí)要放置在4℃下保存。

4.2 糖水解條件

在糖水解的條件中，水解方法有很多，包括完全酸水解（無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸水解），部分酸水解，堿水解等等，水解時(shí)間和封口氣體也受到糖醛酸是否發(fā)生分解和水解是否完全等因素影響，本實(shí)驗(yàn)中參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-8]對(duì)上述條件進(jìn)行考察，最后得出最佳水解條件為110℃下，三氟乙酸水解3h，其中用非氧化性氣體N2封口，此條件下麻黃粗多糖水解完全，含量穩(wěn)定，節(jié)省能源。

4.3 PMP衍生樣品穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)衍生過(guò)程中加入堿的含量、衍生試劑用量、衍生溫度、以及是否需要加入12.5%的磷酸鹽緩沖液維持pH值進(jìn)行了對(duì)比考察，在0.3mol·L-1NaOH溶液和0.5mol·L-1的PMP甲醇溶液體積比1∶2，衍生溫度70℃左右，且衍生時(shí)間在30min以上時(shí)，衍生完全[5-9]。并發(fā)現(xiàn)經(jīng)緩沖液稀釋后的樣品穩(wěn)定性比普通雙蒸水稀釋的樣品穩(wěn)定性高，且峰面積較穩(wěn)定無(wú)較大變化，基線較平穩(wěn)，但是雙蒸水稀釋樣品中，糖醛酸的峰面積會(huì)逐漸下降，難以維持穩(wěn)定。12.5%磷酸鹽緩沖鹽稀釋樣品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

5 結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)總糖中的糖含量的分析，表明麻黃總糖中含量較多的主要單糖為阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖,其中阿拉伯糖和葡萄糖更是占到總糖組成中的60%左右。經(jīng)過(guò)對(duì)水解后的總糖含量減去游離糖含量，換算得到對(duì)應(yīng)單糖的含量[9]，麻黃粗多糖中葡萄糖醛酸不低于12.7mg·g-1，半乳糖醛酸不低于64.5mg·g-1，阿拉伯糖不低于19.5mg·g-1，葡萄糖不低于53.5mg·g-1。本次實(shí)驗(yàn)不僅為麻黃粗多糖中部分單糖的含量測(cè)定提供了依據(jù)，同時(shí)也為麻黃多糖片中單糖含量測(cè)定提供了可靠實(shí)驗(yàn)方法。