隋 新，李 鵬，謝 洋，付 東，張曉臣

（黑龍江省科學院 高技術研究院，黑龍江 哈爾濱150020）

馬勃（Lasiosphaera Calvatia）別名灰包、馬糞包，是一類擔子菌門的真菌通稱，始載于《名醫(yī)別錄》，其干燥子實體可入中藥，具有止血、抗菌、抗癌等功效，臨床上用于多種出血性疾病，如口腔出血、消化道出血及外傷出血等。自20世紀60年代以來，由于馬勃特殊的藥理作用，使其倍受醫(yī)藥界的關注。中國藥典2005版規(guī)定灰包科脫皮馬勃、大馬勃和紫色馬勃的干燥子實體做為藥用馬勃正品[1]。馬勃藥材在我國資源豐富，生于曠野草地，產于內蒙、遼寧、安徽、甘肅、江蘇、云南等地區(qū)[2]。

盡管馬勃具有較好的藥理作用[3-6]，但大部分研究僅僅是對其中所含的化合物進行提取分離，雖然從中得到了不少種類的化合物，現已證實的有氨基酸[7]、甾類化合物[8]、萜類化合物[9]、馬勃多糖[10]、多肽和蛋白質[11,12]，還有一些其它成分如微量元素等，但是對其化合物的藥理活性研究較少。因此，本文利用活性物追蹤分離的方式，采用體外凝血實驗，利用加熱回流提取、有機溶劑萃取等方式對馬勃中止血活性物質進行分離純化，最終得到止血活性部位，此研究將為新型藥物的開發(fā)奠定基礎，為馬勃資源的合理利用及藥用部位的確定提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑、實驗動物與材料

QE-200型高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿有限公司）；EYEL4型平行反應儀（東京理化器械株式會社）；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FD-2型凍干機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；K61型秒表（上海星鉆秒表有限公司）；CS501-SP型水浴鍋（重慶四達實驗儀器廠）；6孔白陶瓷板（上海壘固儀器有限公司）。

95%乙醇（AR西隴化工股份有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司；枸櫞酸鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；生理鹽水（吉林省廣春藥業(yè)有限公司）；蒸餾水（自制）。

健康實驗用哈長耳白兔（體質量2.0～2.5kg，雄性，購于哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心）；云南白藥（云南白藥股份有限公司，規(guī)格：4g，批號：ZDA1602，購于哈爾濱聯想億百大藥房連鎖有限公司）；馬勃藥材購于南極藥材批發(fā)市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 取馬勃干燥藥材適量，用粉碎機粉碎，溶劑為水、45%乙醇、95%乙醇，固液比1∶15，加熱回流提取3次，每次2h，提取結束后過濾得上清液，合并濾液，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得固形物，稱重，計算得率。

1.2.2 萃取方法 按照1.2.1項下提取方法將提取液濃縮至無醇味時停止，按照提取液與溶劑比例為1∶1，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同萃取層，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得固形物，稱重，計算得率。

1.2.3 體外凝血實驗

1.2.3.1 瓷板針挑法 在白瓷板的凹坑內，分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL，再分別加入CaCl2溶液0.1mL，用大頭針把藥液與CaCl2溶液混勻，最后分別同時加入抗凝血液0.5mL，立即計時，迅速用大頭針攪拌混勻且攪拌次數一致。以云南白藥為陽性對照，并設空白對照。以后每30s用大頭針穿過血液輕挑1次，當出現血絲時為開始凝血，當推動血塊時，露出瓷板白底即算血液完全凝固。從加入抗凝血液到血液完全凝固時間為凝血時間。

1.2.3.2 試管法 取內徑為8mm，長10cm的玻璃潔凈試管，每管分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL，再加入CaCl2溶液0.1mL，搖勻，在37℃水浴溫浴1min，然后于各管內同時加入兔血0.5mL，以云南白藥為陽性對照，并設空白對照，蓋緊，倒轉3次，立即計時，在37℃的水浴箱中觀察，每隔30s輕輕傾斜試管1次，角度為30°，觀察血液是否流動，直至傾斜到90°血液不再流動而完全凝固于試管底為止，即為凝血時間。

1.2.3.3 復鈣時間測定 取內徑為8mm，長10cm的潔凈玻璃試管，每管分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL，加入的CaCl2溶液0.1mL，搖勻，在37℃水浴溫浴1min，再于各管內同時加入0.1mL的血漿，同時開動秒表計時，每隔15s傾斜試管1次，在混合液中開始出現彌漫的白色顆粒纖維蛋白絲時，即為復鈣時間。以云南白藥為陽性對照，并設空白對照。

1.2.4 統計學方法 實驗數據均平行測定3次，數據用平均數±標準差（x±s）表示，采用GraphPad軟件進行統計學分析，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，若P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異極顯著，具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 活性提取物的確定

采用不同濃度（v/v）乙醇對馬勃活性物進行提取，得到3種提取物，分別為馬勃水提取物、45%乙醇提取物及95%乙醇提取物，得率見圖1。

圖1 馬勃各提取物得率對比Fig.1 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extract

從圖1中可以看出，隨著乙醇濃度的升高，活性物得率也在增加。得率的增加可能是因為乙醇濃度越高破壞真菌細胞壁的能力越強，使可溶性物質溶出。

分別采用瓷板針挑法、試管法和復鈣時間對3種馬勃提取物進行體外凝血實驗，結果見圖2。

圖2 馬勃各提取物體外凝血實驗結果（瓷板針挑法、試管法、復鈣時間測定）Fig.2 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extract in vitro

從圖2可以看出，馬勃各提取物與空白對照組對比均有不同程度的差異，可以表明馬勃提取物能有效的縮短血液凝聚時間，其中45%乙醇提取物體外凝血效果最佳，所以本實驗選擇45%乙醇提取物進一步分離，尋找止血活性部位。

2.2 活性部位的確定

通過體外凝血實驗篩選馬勃止血活性部位，由于45%乙醇提取物具有凝血活性，所以采用不同極性溶劑對其依次萃取，得率見圖3。

圖3 馬勃各萃取部位得率對比Fig.3 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction

從圖3中可以看出，隨著萃取溶劑極性的增強，得率也在增加。

馬勃不同萃取部位凝血實驗結果表明，5種馬勃萃取物和云南白藥陽性對照組，與空白實驗組相比均有不同程度的差異，說明馬勃各萃取部位均能有效的縮短血液凝聚時間。

圖4 馬勃各萃取部位體外凝血實驗結果（瓷板針挑法、試管法、復鈣時間測定）Fig.4 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction in vitro

從圖4可以看出，馬勃各萃取部位與空白對照組對比均有顯著性差異（p＜0.05），其中正丁醇部位具有較好的止血效果。

3 結論

本文通過活性物追蹤分離的方式，采用加熱回流法對馬勃活性物進行提取，通過體外凝血實驗篩選出馬勃止血活性提取物；對此提取物通過液液萃取的方式從低極性到高極性依次萃取，進一步通過體外凝血實驗篩選出馬勃止血活性部位（正丁醇部位），這為以后活性成分的捕捉提供理論基礎。