練冬梅 賴(lài)正鋒 姚運(yùn)法 林碧珍 洪建基

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL.)錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(Abelmoschus)[1]，又名秋葵(okra)、補(bǔ)腎草、咖啡葵等，一年或多年生草本植物。原產(chǎn)于非洲，20世紀(jì)20年代初從印度引入我國(guó)。黃秋葵作為一種特色的保健型蔬菜，在廣東、福建、山東等地區(qū)均有大規(guī)模種植[2]。在福建省，漳州地區(qū)每年黃秋葵種植面積累計(jì)達(dá)到1 333 hm2，建寧、泰寧和將樂(lè)等地區(qū)種植的黃秋葵品種洋辣、癡椒也已有百年之久[3]。黃秋葵根結(jié)線蟲(chóng)病害主要由南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)引起[4]。隨著黃秋葵生產(chǎn)規(guī)?；?、設(shè)施化和連作化，南方根結(jié)線蟲(chóng)已成為分布最廣、危害最大的植物寄生線蟲(chóng)之一，嚴(yán)重影響黃秋葵的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[5]。因此，黃秋葵南方根結(jié)線蟲(chóng)病防控技術(shù)的研究受到越來(lái)越多關(guān)注，包括黃秋葵嫁接玫瑰茄砧木[6]、篩選抗病品種[5,7-8]等手段?？剐云贩N的選育或抗性基因的挖掘與利用是防治黃秋葵南方根結(jié)線蟲(chóng)最有效的方法之一。

基于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，近年來(lái)在番茄[9]、甘薯[10]、煙草[11]、火參果[12]、苜蓿[13]等植物上已利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)寄主與南方根結(jié)線蟲(chóng)分子互作機(jī)制進(jìn)行了較深入的研究。邢雪霞[11]對(duì)抗、感南方根結(jié)線蟲(chóng)病煙草表達(dá)的289個(gè)差異基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁修飾、蛋白激酶、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)基因共同參與了煙草抗線蟲(chóng)反應(yīng)。Ye等[12]發(fā)現(xiàn)火參果木質(zhì)素的沉積、有毒化合物的合成、細(xì)胞壁的增強(qiáng)、線蟲(chóng)攝食的抑制和抗性蛋白的積累以及多種轉(zhuǎn)錄因子的激活都可能參與了南方根結(jié)線蟲(chóng)的抗性反應(yīng)。Olga等[13]研究了苜蓿抗感材料在被南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染時(shí)的差異表達(dá)基因，認(rèn)為常見(jiàn)基因如抗病蛋白、類(lèi)受體蛋白、假想蛋白等的差異表達(dá)對(duì)苜?？剐云贩N的抗病途徑具有特殊作用。轉(zhuǎn)錄組分析是揭示植物抗病分子機(jī)制的主流方法，可以全面、系統(tǒng)地反映植物的抗病分子機(jī)制。張少平等[14]和姚運(yùn)法等[15]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)黃秋葵的功能基因組學(xué)進(jìn)行相關(guān)研究，但高抗南方根結(jié)線蟲(chóng)病種質(zhì)資源在根結(jié)線蟲(chóng)侵染下的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究采用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序技術(shù)，從分子層面研究和解析黃秋葵抗南方根結(jié)線蟲(chóng)病基因的表達(dá)變化，以期尋找黃秋葵抗病關(guān)鍵基因，為黃秋葵南方根結(jié)線蟲(chóng)病的防治和抗病品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蟲(chóng)源：南方根結(jié)線蟲(chóng)由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，并長(zhǎng)期培養(yǎng)保存于易感黃秋葵上。

黃秋葵種質(zhì)來(lái)自于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，為高抗南方根結(jié)線蟲(chóng)種質(zhì)資源12C2[16]。

1.2 盆栽接種

黃秋葵種子經(jīng)3% H2O2消毒3 min，流水沖洗數(shù)次，將種子催芽露白后播種于盆中，花盆規(guī)格為直徑10 cm、高20 cm?；|(zhì)采用消毒培養(yǎng)土。每盆播5粒種子，播種6盆，待黃秋葵幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，每盆選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3株留作接種試驗(yàn)。接種前，挑取黃秋葵根上南方根結(jié)線蟲(chóng)卵塊，于蒸餾水中孵化24～72 h，制備濃度為1 000 頭·mL-1的2齡幼蟲(chóng)懸浮液。每盆接種2 mL懸浮液(約2 000頭線蟲(chóng))，接種3盆，作為接種線蟲(chóng)處理組；3盆接種等量清水，作為對(duì)照組。

1.3 采樣

分別取未接種和接種18 h后的黃秋葵根尖約1.5 cm，各3個(gè)重復(fù)(未接種的3次生物學(xué)重復(fù)分別記為T(mén)01、T02、T03；接種的3次生物學(xué)重復(fù)分別記為T(mén)04、T05、T06)。迅速放入液氮速凍，存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析

采用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒(天根科技公司)提取黃秋葵根尖總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100技術(shù)檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度和完整性，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，再使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time, PCR)方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，用Illumina Hiseq TM2500(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行高通量測(cè)序。運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)和方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行前期處理、序列比對(duì)、基因及基因組的注釋、基因表達(dá)分析等。按照每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段(fragment per kilobase of exon per million reads mapped, FPKM)法計(jì)算差異基因的表達(dá)量，若log2Fold change>0，則上調(diào)表達(dá)，反之，下調(diào)表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)組裝與分析

接種和未接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的黃秋葵根尖經(jīng)高通量測(cè)序和質(zhì)量控制，共獲得71.49 Gb有效數(shù)據(jù)(clean data)，其Q30堿基百分比均達(dá)到94.0%以上(表1)，表明測(cè)序結(jié)果可靠，可用于后續(xù)分析。對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表2)，共產(chǎn)生53 556條單基因序列(unigene)和166 549條轉(zhuǎn)錄本序列(transcipt)，N50分別為1 654 和1 682 bp，組裝完整性較高；其中長(zhǎng)度為300～500 bp的單基因序列數(shù)量最多，為20 844條，占38.92%，且隨著長(zhǎng)度的增加，單基因序列的數(shù)目減少。

表1 有效數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of clean data

表2 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of assembled results

2.2 unigene功能注釋

為獲得unigene的功能注釋信息，通過(guò)NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、eggNOG、GO和Pfam等8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析(表3)，在53 556條unigene中，共獲得38 196條(71.32%)注釋?zhuān)陨?個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得37 555 (70.12%)、25 627 (47.85%)、15 453

表3 單基因序列的功能注釋Table 3 Function annotated of unigenes

(28.85%)、11 154 (20.83%)、20 381 (38.06%)、34 559(64.53%)、21 510(40.16%)和23 460條(43.80%)注釋。

2.3 差異表達(dá)基因分析

抗病黃秋葵種質(zhì)12C2未接種和接種18 h后根尖差異基因的表達(dá)分析，共獲得2 318個(gè)差異表達(dá)基因(differential expression genes，DEGs)，包括1 156個(gè)上調(diào)基因，1 162個(gè)下調(diào)基因，將其DEGs單基因序列分別在8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋?zhuān)搏@得2 202條基因功能注釋?zhuān)珻OG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和NR分別注釋839、1 122、821、1 102、1 719、1 763、2 095和2 199條，其中以NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋比率最高，達(dá)99.86%。

2.3.1 DEGs的GO功能注釋 抗病黃秋葵種質(zhì)12C2未接種和接種18 h后根尖差異基因GO功能注釋的1 122條DEGs，共分為三大類(lèi)，分別為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能，共劃分為44個(gè)功能小類(lèi)(表4)，生物過(guò)程的DEGs以代謝過(guò)程(49.2%)、細(xì)胞過(guò)程(38.8%)和單一生物過(guò)程(33.9%)3個(gè)功能小類(lèi)的數(shù)量最多；細(xì)胞組分的DEGs以?xún)?nèi)膜(40.2%)、內(nèi)膜組分(34.2%)、細(xì)胞(33.2%)、細(xì)胞組分(32.7%)和細(xì)胞器(20.8%)5個(gè)功能小類(lèi)的數(shù)量最多；分子功能的DEGs以催化活性(56.3%)和結(jié)合活性(43.9%)2個(gè)功能小類(lèi)的數(shù)量最多。

2.3.2 DEGs的KOG功能注釋 抗病黃秋葵種質(zhì)12C2未接種和接種18 h后根尖差異基因KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的1 102條DEGs進(jìn)行直系同源分類(lèi)，并獲得24個(gè)功能分類(lèi)(圖1)，主要集中在R(一般性功能預(yù)測(cè)，17.8%)和O(翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶，11.7%)。植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有大量基因表達(dá)，在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下，部分涉及到了碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(9.3%)，以及次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝(9.1%)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(9.1%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(8.5%)等過(guò)程，說(shuō)明這些生物學(xué)過(guò)程對(duì)于黃秋葵生命活動(dòng)具有重要作用。

注：A：RNA的加工和修飾；B：染色體結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化；C：能源的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化；D：細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂和染色體分配；E：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；F：核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；G：碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；H：輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；I：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制、重組和修復(fù)；M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜的生物發(fā)生；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶；P：無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；Q：次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；R：一般性功能預(yù)測(cè)；S：未知功能；T：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U：細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；V：防御機(jī)制；W： 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Y：核結(jié)構(gòu)；Z：細(xì)胞骨架。Note: A: RNA processing and modification. B: Chromatin structure and dynamics. C: Energy production and conversion. D: Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning. E: Amino acid transport and metabolism. F: Nucleotide transport and metabolism. G: Carbohydrate transport and metabolism. H: Coenzyme transport and metabolism. I: Lipid transport and metabolism. J: Translation, ribosomal structure and biogenesis. K: Transcription. L: Replication, recombination and repair. M: Cell wall/membrane/envelope biogenesis. O: Posttranslational modification, protein turnover, chaperones. P: Inorganic ion transport and metabolism. Q: Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism. R: General function prediction only. S: Function unknown. T: Signal transduction mechanisms. U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport. V: Defense mechanisms. W: Extracellular structures. Y: Nuclear structure. Z: Cytoskeleton.圖1 差異表達(dá)基因KOG功能注釋Fig.1 KOG annotation of DEGs

2.3.3 DEGs的KEGG功能注釋 由表5可知，抗病黃秋葵種質(zhì)12C2未接種和接種18 h后根尖差異基因分別富集在821條KEGG代謝通路，通路主要分為五類(lèi)：第一類(lèi)為細(xì)胞過(guò)程，涉及3個(gè)通路，分別為內(nèi)吞作用、過(guò)氧化物酶體和吞噬體；第二類(lèi)為環(huán)境信息處理，共有1個(gè)通路，為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；第三類(lèi)為遺傳信息處理，涉及5個(gè)通路，以DNA復(fù)制最多；第四類(lèi)為新陳代謝，共有40個(gè)通路，最多的為碳代謝(4.4%)、淀粉和蔗糖的代謝(4.4%)，其次為氨基酸的生物合成(3.4%)；第五類(lèi)為有機(jī)系統(tǒng)，共有1個(gè)通路，為晝夜節(jié)律-植物。

表4 差異表達(dá)基因GO功能注釋Table 4 GO annotation of DEGs

表5 差異表達(dá)基因KEGG功能注釋Table 5 KEGG annotation of DEGs

表5(續(xù))

2.4 差異基因分析

通過(guò)對(duì)抗病黃秋葵種質(zhì)12C2未接種和接種18 h后根尖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能注釋、功能分類(lèi)及代謝途徑分析表明(表6)，線蟲(chóng)侵染黃秋葵根部時(shí)，4個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶基因、4個(gè)聚半乳糖醛酸酶基因、5個(gè)葡聚糖內(nèi)-1,3-β葡糖苷酶基因、4個(gè)果膠裂解酶基因下調(diào)表達(dá)，主要參與細(xì)胞壁組成成分纖維素和果膠質(zhì)的生物代謝過(guò)程；生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因、生長(zhǎng)素流入運(yùn)輸載體基因下調(diào)表達(dá)，茉莉酸合成酶基因上調(diào)表達(dá)，其主要參與植物激素調(diào)控；3個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因、2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)，其主要參與相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控；2個(gè)膜聯(lián)蛋白基因上調(diào)表達(dá)，6個(gè)植物細(xì)胞周期蛋白基因下調(diào)表達(dá)，其主要參與植物細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。

3 討論

運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究南方根結(jié)線蟲(chóng)與黃秋葵的互作，挖掘抗病基因的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。轉(zhuǎn)錄組主要指所有編碼蛋白質(zhì)的mRNA總和[17]，能夠從整體水平探索基因的結(jié)構(gòu)和功能。黃秋葵為非模式植物，需要通過(guò)與同源物種的測(cè)序信息進(jìn)行比對(duì)分析，研究各種特定的生物學(xué)過(guò)程和分子機(jī)理。本研究利用Illumina HiSeq TM2500高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了黃秋葵在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下的根尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，借助其他物種已有數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì)分析，表明線蟲(chóng)侵染后黃秋葵高抗種質(zhì)12C2根尖的植物防御反應(yīng)、植物激素代謝、轉(zhuǎn)錄因子及其他相關(guān)功能蛋白基因的表達(dá)發(fā)生了改變。

植物細(xì)胞壁由纖維素、亞纖維素和果膠質(zhì)組成，它作為第一道防線阻止線蟲(chóng)入侵[18]。線蟲(chóng)能夠分泌細(xì)胞修飾酶類(lèi)侵染植物根部，誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁中的修飾蛋白基因表達(dá)[19]。在本研究中，內(nèi)切葡聚糖酶基因家族、聚半乳糖醛酸酶基因家族和葡聚糖內(nèi)-1,3-β葡糖苷酶基因家族在抗病種質(zhì)12C2中下調(diào)表達(dá)，抑制細(xì)胞壁降解，這可能是黃秋葵對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染的一種防御反應(yīng)。

植物激素幾乎參與了所有的生命活動(dòng)，其對(duì)線蟲(chóng)侵染的響應(yīng)也不例外。植物體中的激素沒(méi)有明顯的專(zhuān)一性，一種激素可以調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，而多種激素又具有調(diào)節(jié)同一生理過(guò)程的作用[20]。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，生長(zhǎng)素和茉莉酸主要調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以應(yīng)對(duì)線蟲(chóng)入侵。在本研究中，生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因、生長(zhǎng)素流入運(yùn)輸載體基因下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞中生長(zhǎng)素含量下降，生長(zhǎng)素?zé)o法大量積累可能導(dǎo)致根部巨型細(xì)胞的大量形成受阻，這與前人研究黃瓜[21]和煙草[22]對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)抗性的結(jié)論一致。茉莉酸作為一種信號(hào)物質(zhì)，其過(guò)量表達(dá)可以提高番茄對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的防御[23]，說(shuō)明茉莉酸合成酶上調(diào)表達(dá)，有利于黃秋葵抗南方根結(jié)線蟲(chóng)。

在植物根部受根結(jié)線蟲(chóng)侵染后形成根結(jié)的過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控起關(guān)鍵性作用[24-26]。鄭井元[27]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒受到南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后會(huì)引起WRKY轉(zhuǎn)錄因子的強(qiáng)烈表達(dá)。魏瀟[28]研究表明，紅根甘肅桃通過(guò)MYB調(diào)控增加南方根結(jié)線蟲(chóng)抗性。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，黃秋葵高抗種質(zhì)12C2受南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后，WRKY、MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族上調(diào)表達(dá)，有利于增強(qiáng)南方根結(jié)線蟲(chóng)抗性，與前人研究結(jié)果一致。

表6 南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下黃秋葵部分差異基因的表達(dá)Table 6 Some DEGs of okra under M. incognita infect

膜聯(lián)蛋白是一種位于質(zhì)膜上的鈣磷脂結(jié)合蛋白，在植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境時(shí)具有重要作用[29]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，膜聯(lián)蛋白生物活性被激活，特異地提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，提高植物抗逆性[30]。在本研究中，膜聯(lián)蛋白基因家族上調(diào)表達(dá)，增加了黃秋葵種質(zhì)12C2對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的抗性。在植物與線蟲(chóng)親和反應(yīng)中，細(xì)胞周期蛋白基因在線蟲(chóng)侵染后被激活[31]，本研究中植物細(xì)胞周期蛋白基因家族下調(diào)表達(dá)，能夠抑制根部巨型細(xì)胞的形成。

4 結(jié)論

在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下，抗病黃秋葵種質(zhì)12C2在一系列關(guān)鍵基因家族(內(nèi)切葡聚糖酶基因家族、聚半乳糖醛酸酶基因家族、葡聚糖內(nèi)-1,3-β葡糖苷酶基因家族、果膠裂解酶基因家族、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因、生長(zhǎng)素流入運(yùn)輸載體基因、茉莉酸合成酶基因、WRKY、MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族、膜聯(lián)蛋白基因和植物細(xì)胞周期蛋白基因家族)共同作用下進(jìn)行自我防御，能夠抵御南方根結(jié)線蟲(chóng)的侵染。本研究從分子水平分析了抗病基因及其差異表達(dá)，為篩選黃秋葵抗南方根結(jié)線蟲(chóng)關(guān)鍵基因和功能驗(yàn)證提供了重要的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)黃秋葵南方根結(jié)線蟲(chóng)病防治及抗病品種選育具有重要意義。