陳其釗，林燕純，劉志鵬*，陳嘉敏，李長成，王桂華，李家威，余構(gòu)彬

1(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東 廣州，510316) 2(汕頭普羅凱融生物醫(yī)藥科技有限公司，廣東 汕頭，515000)

紅糖產(chǎn)品(紅糖，黑糖，赤砂糖)因其保留了甘蔗原有的風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)，礦物質(zhì)，維生素，酚類物質(zhì)，有機(jī)酸，植物甾醇等非糖成分)，符合天然健康的飲食觀念[1-2]，享有健脾養(yǎng)胃、溫中補(bǔ)氣、緩解精通的溫補(bǔ)美譽(yù)，深受消費(fèi)者喜愛。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，其保健功能物質(zhì)基礎(chǔ)可能與紅糖產(chǎn)品中的非糖成分有密切關(guān)系[3-9]。甘蔗甾醇含量高，抗炎、降血脂、緩解非酒精性脂肪肝化能力強(qiáng)[10-13]，紅糖作為甘蔗全汁濃縮物，甘蔗甾醇在傳統(tǒng)提取濃縮工藝中自然進(jìn)入紅糖產(chǎn)品，但目前對傳統(tǒng)工藝紅糖產(chǎn)品的甾醇類成分研究報道較少。為探討傳統(tǒng)紅糖的保健功能及機(jī)制，了解紅糖產(chǎn)品中甾醇的含量及其在加工過程中的變化,本文建立了一種高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定紅糖產(chǎn)品中5種植物甾醇含量的方法，并對紅糖產(chǎn)品中3種常見的甾醇含量進(jìn)行了分析測定,以期為紅糖產(chǎn)品的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1290)，安捷倫科技(中國)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA RV8)、旋渦混合器(VORTEX 3)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋(DKZ-2B)，上海一恒科技有限公司；醫(yī)用離心機(jī)(CL5R)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，默克密理博公司。

甲醇、乙腈(色譜純)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、KOH，無水乙醇(分析純)，廣州化學(xué)試劑有限公司。

色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；ZORBAX SB C8RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：麥角甾醇、膽甾醇、豆甾醇、β谷甾醇和菜油甾醇(純度≥95%)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

96批次食糖樣品均來自2017～2019年廣東、廣西、云南3個不同產(chǎn)地，其中41個紅糖樣品，11個黑糖樣品，44個赤砂糖樣品。在分析之前，所有食糖樣品都儲存在塑料罐中，陰涼避光保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件：

Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)液相色譜柱；檢測波長205 nm(β-谷甾醇，菜油甾醇，膽甾醇和豆甾醇最大吸收波長)，282 nm(麥角甾醇最大吸收波長)；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。流動相：A相為水，B相為乙腈；采用梯度洗脫，0～9.5 min 80%～90% B相。

1.2.2 供試品溶液的制備

取約3.0 g樣品置于錐形瓶中，加入無水乙醇溶液旋渦提取30 min，以體積比1∶1加入50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液，搖勻，在80 ℃水浴中皂化60 min，冷卻后加入水10 mL，并移入分液漏斗中，用15 mL二氯甲烷分3次萃取，合并萃取液，旋干，用甲醇2 mL復(fù)溶，用0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC進(jìn)樣。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量麥角甾醇、膽甾醇、豆甾醇、β谷甾醇和菜油甾醇，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別制成約1.0 mg/mL的儲備液，于4 ℃下避光儲存?zhèn)溆?。取適量部分上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1～100 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長選擇

在190～400 nm下分別對5種甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇的最大吸收波長為282 nm，膽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇在205 nm處有最強(qiáng)吸收(見圖1)，因此麥角甾醇的檢測波長選擇282 nm，膽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇的檢測波長選擇205 nm。

A-麥角甾醇；B-膽甾醇；C-菜油甾醇； D-豆甾醇；E-β-谷甾醇圖1 5種植物甾醇的吸收光譜圖(掃描波長190～640 nm)Fig.1 Adsorption chromatography of 5 phytosterols

2.1.2 色譜柱選擇

嘗試了安捷倫ZORBAX SB C8RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)三款色譜柱。發(fā)現(xiàn)C18對4種成分的分離效果好，但是運(yùn)行比較長，在超高效色譜系統(tǒng)需要28 min才能完全出峰。不同牌子的C8色譜柱對于分離情況也有區(qū)別，相同流動相，相同梯度下ZORBAX SB C8RRHD柱不能分離菜油甾醇和豆甾醇，Waters ACQUITY UPLC BEH C8則能實現(xiàn)8 min內(nèi)5種成分完全分離。

2.1.3 流動相選擇

流動相：甲醇截止波長為205 nm;乙腈截止波長為190 nm，而膽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇的最大吸收波長為205 nm，在甲醇水系統(tǒng)下，基線漂移嚴(yán)重。故選擇乙腈水作為流動相。嘗試了乙腈-水100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、80∶20(體積比)等多種等度洗脫，均無法實現(xiàn)菜油甾醇和豆甾醇的分離。梯度洗脫：0～9.5 min乙腈80%～90%，則能5種成分完全基線分離；流速，柱溫對峰位和組分分離影響不大。在此條件下菜籽甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇分離情況良好，滿足定量分析要求，見圖2、圖3。

A-205 nm；B-282 nm；1-麥角甾醇;2-膽甾醇;3-菜油甾醇;4-豆甾醇;5-β-谷甾醇圖2 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard

A-205 nm；B-282 nm；1-麥角甾醇;2-膽甾醇;3-菜油甾醇;4-豆甾醇;5-β-谷甾醇圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

2.1.4 提取方法的優(yōu)化

文獻(xiàn)報道的提取方法大多數(shù)使用回流皂化，溶劑萃取再濃縮，耗費(fèi)時間比較長，操作復(fù)雜[10-13]。也有針對樣品基質(zhì)比較簡單的，僅需超聲或渦旋提取，皂化即得[14-20]。因為糖品的基質(zhì)較簡單，所以本文也采用直接提取皂化法。前期在文獻(xiàn)總結(jié)的基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法對超聲提取時間、料液比、皂化時間和萃取次數(shù)進(jìn)行實驗探究和優(yōu)化，得到5種甾醇的提取工藝條件為：料液比為1∶10，提取時間為19.58 min，皂化時間1 h，萃取次數(shù)3次，提取總量預(yù)測為20.012 μg。對預(yù)測的最佳工藝條件進(jìn)行了驗證并結(jié)合實際操作，將驗證條件修正為料液比為1∶10，提取時間為20 min，皂化時間1 h，萃取次數(shù)3次。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍

精密吸取混合對照品儲備液一定體積，按倍數(shù)關(guān)系稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，采用優(yōu)化后的前處理方法以及色譜條件，以5種甾醇色譜峰的峰面積平均值(Y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以信噪比S/N=3確定儀器檢出限。結(jié)果如表1所示，5種植物甾醇在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 7；麥角甾醇檢出限均為0.023 mg/kg，膽甾醇為0.14 mg/kg，菜油甾醇為0.18 mg/kg，豆甾醇為0.11 mg/kg，β-谷甾醇為0.17 mg/kg，方法靈敏度較高，可滿足糖品中甾醇檢測需要。

表1 方法的線性范圍、回歸方程及檢出限Table 1 Linear range，linear equations and limits of detection of the method

2.2.2 精密度試驗

取供試品溶液按照1.2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇峰面積的精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)分別為1.6%、3.9%、1.3%、0.20%、0.29%表明儀器的精密度良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率

精確稱取紅糖樣品3.0 g，按重復(fù)性結(jié)果計算得到5個甾醇成分的含量，分別加入3個水平的對照品，在最佳提取條件及色譜條件下，每一濃度平行3次測定紅糖中植物甾醇的回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，紅糖中麥角甾醇的平均回收率為74.4%～95.8%，膽甾醇的平均回收率為82.3%～91.4%，菜油甾醇的平均回收率為84.6%～102.5%，豆甾醇的回收率為88.0%～92.1%，β-谷甾醇的回收率為75.4%～92.6%。

表2 方法的回收率(n=6)Table 2 Recovery of the method(n=6)

2.3 樣品含量測定與聚類分析

2.3.1 樣品含量測定

取96批不同產(chǎn)地和級別的紅糖，黑糖和赤砂糖樣品按優(yōu)化后的最佳提取條件和最優(yōu)色譜條件進(jìn)行含量測定，按2.4.1中的線性方程計算麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量，結(jié)果見表3。由表3可知，所測96個樣品中大部分含有5種植物甾醇。5種植物甾醇以豆甾醇和β-谷甾醇含量較高，可達(dá)244.41 mg/kg、67.38 mg/kg，麥角甾醇含量最低。

3種糖品中平均總甾醇含量差異明顯，分布為紅糖>黑糖>赤砂糖。GB/T 35886—2018[21]食糖分類中提到，紅糖是糖汁清凈處理后直接煉煮不經(jīng)分蜜制成。而赤砂糖則是經(jīng)過了分蜜制成，是工業(yè)化生產(chǎn)白砂糖的副產(chǎn)品。目前還沒有黑糖的國家標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)DB 4413/T 10—2019[22]和QB/T 4567—2013[23]描述其生產(chǎn)工藝與紅糖相似，只是煉煮的顏色差異。因此總甾醇含量差異可能與3種糖品的生產(chǎn)工藝或產(chǎn)地有關(guān)，但還需進(jìn)一步分析研究。

從糖品的等級上看，無論紅糖的優(yōu)級、一級和二級還是赤砂糖的一、二級，在總甾醇含量上并沒有多大區(qū)分。

表3 實際樣品的測定結(jié)果 單位：mg/kg

2.3.2 聚類分析

綜合不同產(chǎn)地和級別的糖品中麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量和甾醇總含量這6個指標(biāo)，借助SPSS軟件并采用系統(tǒng)聚類法中的Ward 聯(lián)結(jié)和平方Euclidean距離系數(shù)對紅糖，黑糖，赤砂糖樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4～圖6所示。

圖4 紅糖聚類分析樹狀圖Fig.4 Brown sugar cluster analysis dendrogram

圖5 黑糖聚類分析樹狀圖Fig.5 Dark brown sugarcluster analysis dendrogram

圖6 赤砂糖聚類分析樹狀圖Fig.6 Brown granulated suga rcluster analysis dendrogram

由圖4可知，41個紅糖樣品可分為四大類。第一類為2、18～25、27、31、33、35～37號樣品，第二類為1、4、6、7、14、16、26、28、29、30、32、34號樣品，第三類為3、5、8、9、11～13、15、17、38～41號樣品；10號樣品與其他樣品間距較大，分一類。

由圖5可知，11個黑糖樣品可分為三大類。第一類為44～47、50～52號樣品，第二類為42、49號樣品，第三類為43、48號樣品；

由圖6可知，44個赤砂糖樣品可分為五大類。第一類為53～56、59～60、62、64、67、70、72～79、82、84～86、88、91、94、96號樣品，第二類為71、83、92～93號樣品，第三類為61、63、65、69、80、81、87、89、90、95號樣品；第四類為58、66、68號樣品；57號樣品與其他樣品間距較大，分為一類。

3 結(jié)論

本文通過對3種糖品的前處理和色譜條件的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜法同時測定紅糖中麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇這5種植物甾醇的方法。對3種糖品96個樣本中5種植物甾醇的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中5種植物甾醇以豆甾醇和β-谷甾醇含量較高，麥角甾醇含量最低，不同糖品中總甾醇成分含量差異較大，分布為紅糖>黑糖>赤砂糖。植物甾醇作為具有一定藥用價值的成分，研究其在紅糖產(chǎn)品中的含量可為其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考，為其合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。