袁爾東 黃 敏 李 良 楊宜婷 任嬌艷，3*

（1 華南理工大學食品科學與工程學院 廣州510641 2 無限極（中國）有限公司 廣州510665 3 中新國際聯(lián)合研究院 廣州510006）

猴頭菇（Hericium erinaceus）又名猴頭、猴頭蘑、猴頭菌、刺猬菌等，是一種大型真菌，屬擔子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬，因其子實體形狀像猴子頭部而得名。猴頭菇含有豐富的蛋白質、脂肪、纖維素、多糖及多種氨基酸，子實體和菌絲體均可入藥，性平味甘，具有助消化、利五臟的功能[1]。其中，猴頭菇多糖是猴頭菇的主要活性成分。它是由10 個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，存在于菌絲、子實體和發(fā)酵液中，是目前研究最多的猴頭菇活性成分之一。大量的醫(yī)學和藥理學研究表明，猴頭菇多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂等生理功能[2]。其中，關于猴頭菇多糖對胃黏膜保護作用的研究較少。本文以猴頭菇菌絲體/子實體粗多糖為原料，對其進行初步提純，從細胞水平上研究其胃黏膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇子實體粗多糖、猴頭菇菌絲體粗多糖，由無限極（中國）有限公司提供；吲哚美辛，Sigma公司；人胃黏膜上皮細胞（GES-1），南方醫(yī)科大學友情提供；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗、胰酶Trypsin-EDTA、PBS，廣州真知生物科技有限公司。

1.2 主要儀器、設備

UV754N 紫外分光光度計，上海儀電有限公司；H2050R 高速離心機，湘儀動力測試儀器有限公司；TDZ4-WS 低速自動平衡離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；HERAcell150i CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo Scientific；THZ-82A 恒溫振蕩器，常州溪華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇菌絲體/子實體多糖的提純 將猴頭菇菌絲體粗多糖及子實體粗多糖原料初步提純，選擇提取溫度為70，80，90 ℃，提取時間1，2，3 h，料液比1∶10，1∶15，1∶20 進行單因素提取[3]。提取2 次，合并提取液，濃縮后以80%乙醇沉淀過夜、過濾、冷凍干燥，最后得到猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖。

1.3.2 多糖純度的測定 參考張素斌等[4]的測定方法，稍作修改。準確吸取0.1 mg/mL 葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置于試管中，各加入蒸餾水使總體積為2.0 mL，再加入質量分數(shù)5%的苯酚溶液1 mL，搖勻。迅速加入5 mL 濃H2SO4，搖勻，沸水浴加熱15 min 后取出冷卻至室溫。于波長490 nm 處測定吸光度A，得出A 與質量濃度c （mg/mL） 的葡萄糖標準曲線的回歸方程：A=0.01446c+0.04129，R2=0.9981。

吸取一定體積的樣品溶液，用同樣方法檢測，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算樣品的總糖含量。

1.3.3 胃黏膜保護作用細胞試驗

1.3.3.1 細胞培養(yǎng) 將GES-1 細胞置于DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%雙抗）中，于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2。當培養(yǎng)皿中細胞生長近80%細胞基本貼壁時，用0.25%胰酶1～2 mL 在培養(yǎng)箱內消化2～3 min，在顯微鏡下觀察到細胞變圓、散開時，加入4～5 mL DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min 離心5 min，重懸均勻后在小皿中繼續(xù)培養(yǎng)[5]。

1.3.3.2 MTT 試驗 取對數(shù)生長的GES-1 細胞消化計數(shù)后接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 至細胞基本貼壁。將猴頭菇多糖用DMEM 稀釋成15.625，32.250，62.500，125.000，250.000 μg/mL，分別加入各孔中，每孔100 μL。每一稀釋度設置5 個復孔，同時設立空白對照組。37 ℃、5%CO2溫育24 h 后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)使其反應4 h，小心用注射器吸取孔內培養(yǎng)液，丟棄。然后，每孔加入150 mL DMSO 溶液，放入酶標儀中，振板10 min，測定其波長490 nm 處吸光值。每個樣品獨立測量3 次，計算各組細胞的相對存活率。

1.3.3.3 GES-1 細胞損傷模型的構建 取對數(shù)生長的GES-1 細胞消化計數(shù)后接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h至細胞基本貼壁。將造模藥物吲哚美辛用DMEM培養(yǎng)基稀釋成0.4，0.8，1.2，1.6，2 mmol/L[6]，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌后分別加入各孔中，每孔100 μL。每一稀釋度設置5 個復孔，同時設立空白對照組。37 ℃、5%CO2溫育24 h 后做MTT 試驗。

1.3.3.4 猴頭菇多糖對吲哚美辛誘導的GES-1 細胞損傷的保護作用 取對數(shù)生長的GES-1 細胞消化計數(shù)后接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個。將GES-1 細胞隨機分為5 組：空白對照組、模型組以及3 個試驗組，每組設置5 個復孔。待細胞完全貼壁后，將每孔細胞培養(yǎng)液吸走，空白對照組和模型組加入DMEM 培養(yǎng)基100 μL/孔，試驗組則分別加入 15.625，32.250，62.500 μg/mL的猴頭菇多糖樣品100 μL/孔，繼續(xù)孵育24 h。除空白對照組外，其余各組加入2.0 mmol/L 吲哚美辛溶液100 μL/孔，37 ℃、5%CO2溫育24 h 后 做MTT 試驗。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測定結果以P<0.05 為顯著性評定指標，數(shù)據(jù)用x±SD 表示。采用Graph prism 制圖，并用SPSS 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 吲哚美辛誘導GES-1 細胞損傷模型

非甾體抗炎藥（NSAIDs）是最常用于治療關節(jié)炎，炎癥和心血管保護的藥物，同時也經(jīng)常引起胃腸道并發(fā)癥[7]。其原因主要是由于NSAIDs 可抑制環(huán)氧合酶COX-1、COX-2 的作用，使得具有胃腸道黏膜保護作用的前列腺素的合成減少，從而引起胃腸道黏膜血供減少，進一步損傷黏膜上皮，導致糜爛和潰瘍形成[8-9]。選用NSAIDs 吲哚美辛進行人胃黏膜上皮細胞 （GES-1） 損傷模型的構建。

由圖1可知，不同濃度的吲哚美辛誘導的GES-1 細胞損傷的存活率具有顯著性差異 （P<0.05）。隨著吲哚美辛濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，當吲哚美辛濃度為1.6 mmol/L 時，細胞存活率下降趨勢緩慢；當吲哚美辛濃度為2.0 mmol/L 時細胞存活率約為60%[10]。最終選擇2.0 mmol/L吲哚美辛誘導24 h，成功構建GES-1 細胞損傷模型。

2.2 猴頭菇粗多糖對GES-1 細胞的保護作用

2.2.1 猴頭菇粗多糖對GES-1 細胞的增殖作用

由圖2可知，猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖均能顯著促進GES-1 細胞的增殖，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關系。

圖2 猴頭菇粗多糖對GES-1 細胞的影響Fig.2 Effect of crude polysaccharide from Hericium erinaceus on GES-1 cell

2.2.2 猴頭菇粗多糖對受損GES-1 細胞的保護作用 由圖3可知，猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖可明顯提高受損GES-1 細胞的存活率。與空白對照組相比，模型組的細胞存活率均明顯下降，說明吲哚美辛對GES-1 細胞具有明顯的損傷作用，GES-1 細胞損傷模型造模成功[11]。與模型組相比，試驗組的細胞存活率明顯上升，說明兩種粗多糖對受損GES-1 細胞具有明顯的保護作用。

圖3 猴頭菇菌絲體粗多糖（a）、子實體粗多糖（b）對受損GES-1 細胞存活率的影響Fig.3 Effect of crude polysaccharide from Hericium erinaceus mycelium （a） and fruiting body crude polysaccharide （b）on the cell viability of injured GES-1 cells

2.3 猴頭菇粗多糖提純工藝的優(yōu)化

分別在不同料液比、提取溫度及提取時間的條件下，對猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖進行提純，以多糖純度及對吲哚美辛損傷GES-1細胞的保護作用為指標，對其提純工藝條件進行優(yōu)化。

2.3.1 料液比 如圖4a、5a 所示，在提取料液比1∶15 的條件下，得到菌絲體多糖和子實體多糖的純度均較高，其對受損細胞的保護作用也最明顯。最終選擇最佳提取料液比為1∶15。

由圖4和圖5可知，猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖的多糖純度不盡相同，這與其生長環(huán)境和培養(yǎng)方式等密切相關[12]。菌絲體多糖純度均在50%～60%，而子實體多糖純度在40%～50%，猴頭菇菌絲體多糖的純度稍高于子實體多糖。在提取料液比1∶15 條件下得到的菌絲體多糖和子實體多糖的多糖純度均明顯較高。

由圖4b、4c 和圖5b、5c 可知，猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖均可明顯提高受損GES-1 細胞的存活率（P<0.05），說明它們對吲哚美辛誘導的細胞損傷保護作用明顯。當料液比為1∶15 時，猴頭菇菌絲體多糖組和子實體多糖組的細胞存活率均高于其它兩組，表明此料液比下多糖的細胞保護作用較好。

圖4 不同料液比條件下猴頭菇菌絲體多糖純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用Fig.4 Hericium erinaceus mycelium polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different solid-liquid ratios

圖5 不同料液比條件下猴頭菇子實體多糖的純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用Fig.5 Hericium erinaceus fruit body polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different solid-liquid ratios

2.3.2 提取溫度 如圖6、圖7所示，溫度對猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖的提純影響顯著，在80 ℃條件下得到菌絲體和子實體多糖的純度均較高，對吲哚美辛損傷細胞的保護作用也最明顯。最終選擇最佳提取溫度為80 ℃。

由圖6a 和圖7a 可知，不同溫度條件下提取得到的猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖的多糖純度也有所不同，80 ℃條件下得到的多糖純度較高。

由圖6b、6c 和圖7b、7c 可知，不同提取溫度條件下猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖均可明顯提高受損GES-1 細胞的存活率（P<0.05）。當提取溫度為80 ℃時猴頭菇菌絲體多糖組和子實體多糖組的細胞存活率均略高于其它兩組，表明此溫度下多糖對受損GES-1 細胞保護作用較好。

圖6 不同提取溫度下猴頭菇菌絲體多糖純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用Fig.6 Hericium erinaceus mycelium polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different extraction temperatures

圖7 不同提取溫度條件下猴頭菇子實體多糖的純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用Fig.7 Hericium erinaceus fruit body polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells under different extraction temperatures

2.3.3 提取時間 如圖8、圖9所示，提取時間不同，得到猴頭菇菌絲體和子實體多糖的純度和受損GES-1 細胞的保護作用也不相同，其中以提取2 h 條件下的效果為最佳。最終選擇最佳提取時間為2 h。

圖8 不同提取時間下猴頭菇菌絲體多糖的純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用Fig.8 Hericium erinaceus mycelium polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different extraction times

圖9 不同提取時間的猴頭菇子實體多糖純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用Fig.9 Hericium erinaceus fruit body polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different extraction times

由圖8a 和圖9a 可知，不同提取時間條件下猴頭菇菌絲體和子實體多糖純度有所不同，提取時間2 h 條件下多糖純度較高。

由圖8b、8c 和圖9b、9c 可知，不同提取時間條件下猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖可明顯提高受損GES-1 細胞的存活率（P<0.05）。其中，以提取2 h 后得到的猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖對受損CES-1 細胞的保護效果為最好。

2.4 最優(yōu)工藝條件下猴頭菇多糖純度及其對受損GES-1 細胞的保護作用

研究表明，不同部位的原料以及提取條件、菌種以及生長條件等，都影響多糖含量[13-14]。

根據(jù)上述工藝優(yōu)化試驗，得到猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖的最優(yōu)提純工藝條件：料液比1∶15、提取溫度80 ℃、提取時間2 h。在此條件下，由猴頭菇粗多糖提取到的猴頭菇多糖純度明顯提高（圖10）。其中，菌絲體多糖純度由40%增到50%，子實體多糖純度由35%增到42%。同時，提純的猴頭菇多糖對受損GES-1 細胞的保護作用也明顯增強（圖11），其細胞存活率明顯提高。

圖10 猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖提純前、后多糖純度的對比Fig.10 Comparison of polysaccharides’ purity before and after purification of Hericium erinaceus

圖11 猴頭菇菌絲體多糖（a）、子實體多糖（b）對受損GES-1 細胞存活率的影響Fig.11 Effect of Hericium erinaceus mycelium polysaccharide （a） and fruiting body polysaccharide（b）on cell viability of injured GES-1 cells

3 結論

1）猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖均能顯著促進GES-1 細胞的增殖，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關系。兩種粗多糖對吲哚美辛誘導的GES-1 細胞損傷有明顯的保護作用，可提高其細胞存活率。

2）以多糖純度及對受損GES-1 細胞的保護作用為指標，對猴頭菇菌絲體粗多糖和子實體粗多糖提純工藝條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)提純工藝條件：料液比1∶15、提取溫度80 ℃、提取時間2 h。在此條件下，菌絲體多糖純度由40%增到50%，子實體多糖純度由35%增到42%。同時，提純后的猴頭菇菌絲體多糖和子實體多糖對受損GES-1 細胞的保護作用也明顯較強，其細胞存活率明顯提高。