劉莉園，張?zhí)?，張釗，崔香丹，尹學(xué)哲，全吉淑，*

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000）

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管以及心臟內(nèi)膜的重要組成成分，具有多種重要的生理功能，如調(diào)節(jié)血管張力、傳遞血管信息，同時還可以產(chǎn)生和釋放多種血管活性物質(zhì)[1]。研究表明，多種因素均可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，如氧化低密度脂蛋白、腫瘤壞死因子-α、氧化應(yīng)激、同型半胱氨酸等[2-5]。內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙以及結(jié)構(gòu)損傷可能是各種心腦血管疾病，特別是動脈粥樣硬化的起始因素之一[6]。因此，防止血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生及進(jìn)展對于防治動脈粥樣硬化及其他多種心腦血管相關(guān)疾病均具有非常重要的意義。

草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov）為列當(dāng)科草蓯蓉屬植物，具有極高的藥用價值，多糖是其重要的活性成分[7]。研究表明，草蓯蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides，BRPS）具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種作用[8-9]。課題組前期研究還表明，草蓯蓉多糖可清除血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)自由基，抑制氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[10]。因此，本研究采用叔丁基過氧化氫（tert-butylhydroperoxide，t-BHP）損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞制備人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）凋亡模型，探討 BRPS 對 t-BHP 所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，旨在為草蓯蓉在心腦血管疾病防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BRPS：延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室自制（純度86.5%），過濾除菌后備用[10-11]。HUVEC細(xì)胞：南京凱基生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：Biological Industries公司；胎牛血清：美國Gemini公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒：北京莊盟國際生物基因科技有限公司；兔胱天蛋白酶原（pro-cysteine aspastic acid-specific protease，Procaspase）-3 抗體、兔 Procaspase-8抗體、兔Procaspase-9抗體、兔細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）抗體、兔p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38）抗體、兔p-ERK抗體、兔磷酸化c-Jun N末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體、小鼠 p-p38抗體、兔 Survivin 抗體、小鼠p53抗體、兔聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抗體、兔核轉(zhuǎn)錄因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）抗體：美國 CST 公司；兔JNK1/2抗體：美國Abcam公司；小鼠β-actin抗體、兔抗小鼠二抗、羊抗兔二抗：美國Sigma-Aldrich公司；電化學(xué)發(fā)光（electro-chemi-luminescence，ECL）檢測試劑盒：Merck millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZCOR-1150二氧化碳培養(yǎng)箱：美國寶特公司；DYCZ-24DN垂直板電泳儀：北京市六一儀器廠；全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)：美國UVP公司；FACSCanto II流式細(xì)胞儀：美國BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HUVEC細(xì)胞用含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，將HUVEC細(xì)胞放置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的CO2培養(yǎng)箱中，每1 d～每2 d更換一次新的培養(yǎng)基或者進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)[10-12]。將細(xì)胞分為3組，即正常組、t-BHP組（損傷組）和BRPS組，正常組細(xì)胞換入無血清培養(yǎng)液；損傷組細(xì)胞加入t-BHP溶液，使其終濃度為200 μmol/L，并損傷8 h；BRPS組細(xì)胞加入BRPS溶液，使其終濃度達(dá)到50 mg/L，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，再加入200 μmol/L t-BHP誘導(dǎo)損傷8 h。

1.3.2 BRPS對t-BHP損傷HUVEC細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞分組及處理按照1.3.1的方法進(jìn)行，按常規(guī)CCK-8法計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率/%=OD試驗組/OD正常組×100

1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞分組及按照1.3.1的方法處理之后，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集于離心管中，低溫高速離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，棄去上清，再加入4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min再次離心，棄上清，加入300 μL結(jié)合緩沖液，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成懸浮液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106cell/mL，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI溶液，移液器吹打混勻，室溫避光孵育5 min～15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測，并計算細(xì)胞凋亡率。

凋亡率/%=早期凋亡率+晚期凋亡率

1.3.4 Western blotting技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

蛋白樣品制備：細(xì)胞分組及處理方法同1.3.1，用4℃預(yù)冷的PBS清洗3遍，加入適量含蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制的RIPA裂解液，將培養(yǎng)皿放在冰上裂解細(xì)胞30 min，每隔5 min晃勻一次，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集到預(yù)冷的離心管中，低溫高速離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心20 min，小心抽取上清液，蛋白定量后，加入5倍上樣緩沖液，樣品于沸水浴煮沸10 min左右，制備好的蛋白樣品于-80℃保存?zhèn)溆?。Western blotting實驗：取30 μg蛋白樣品，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，漂洗之后與相應(yīng)一抗4℃下孵育過夜，漂洗之后加入相應(yīng)二抗25℃孵育2 h，漂洗，ECL顯色、曝光、分析條帶。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS20.0軟件，計量資料用x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1BRPS對t-BHP誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞活力及凋亡的影響

t-BHP可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡，而CCK-8法和Annexin VFITC/PI雙染法分別是檢測細(xì)胞活力和凋亡最為常用的檢測的方法[13]，BRPS對t-BHP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力及凋亡的影響見圖1。

圖1BRPS對t-BHP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力及凋亡的影響Fig.1 Effect of BRPS on viability and apoptosis of HUVEC induced by t-BHP

由圖1可見，正常組可見少量早期凋亡和中晚期凋亡，損傷組可見大量早期凋亡和中晚期凋亡，BRPS保護(hù)后凋亡細(xì)胞明顯變少。CCK-8法和Annexin VFITC/PI雙染法顯色結(jié)果顯示，與正常組比較，損傷組HUVEC細(xì)胞活力降低50.6%（P＜0.05），凋亡率升高41.0%（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組 HUVEC活力升高 16.4%（P＜0.05），凋亡率降低 22.2%（P＜0.05）。

2.2 BRPS對HUVEC細(xì)胞Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9蛋白表達(dá)的影響

半胱天冬酶級聯(lián)系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)凋亡信號的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增中起重要作用，其激活主要依賴線粒體途徑和死亡受體途徑，激活后下游Caspase通過切割特異性底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]，BRPS對HUVEC細(xì)胞Caspase前體蛋白表達(dá)的影響見圖2。

圖2BRPS對HUVEC細(xì)胞Caspase前體蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of BRPS on protein expression of procaspases in HUVEC

由圖2可見，與正常組比較，損傷組HUVEC細(xì)胞中 Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS 組 Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

2.3BRPS對HUVEC細(xì)胞PARP蛋白表達(dá)的影響

PARP為Caspase-3的特異性底物，Caspase-3激活可促使其發(fā)生剪切，促使細(xì)胞凋亡[14]，BRPS對HUVEC細(xì)胞PARP蛋白表達(dá)以及切割產(chǎn)物Cleaved-PARP水平的影響見圖3。

由圖3可見，與正常組比較，損傷組PARP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組 PARP 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

圖3BRPS對HUVEC細(xì)胞PARP蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of BRPS on protein expression of PARPs in HUVEC

2.4 BRPS對HUVEC細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響

Survivin是凋亡抑制因子家族中最小的成員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[15]，BRPS對HUVEC細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響見圖4。

圖4BRPS對HUVEC細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of BRPS on protein expression of survivin in HUVEC

由圖4可見，與正常組比較，損傷組Survivin蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組Survivin蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

2.5 BRPS對HUVEC細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響

p53是腫瘤抑制蛋白，參與細(xì)胞周期控制、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程。p53激活通過線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞色素c從線粒體釋放，Caspase-9激活，然后激活Caspase-3、6和7，最終引起細(xì)胞凋亡[16]，BRPS對HUVEC細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響見圖5。

由圖5可見，與正常組比較，損傷組p53蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組 p53蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

2.6 BRPS對HUVEC細(xì)胞核NF-кB蛋白表達(dá)的影響

NF-кB與細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥等過程密切相關(guān)，并且具有抗凋亡和抑凋亡的雙向作用[17]，BRPS對HUVEC細(xì)胞核NF-кB蛋白表達(dá)的影響見圖6。

圖6BRPS對HUVEC細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of BRPS on protein expression of nuclear NF-кB in HUVEC

由圖6可見，與正常組比較，損傷組細(xì)胞核NF-кB蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組細(xì)胞核NF-кB蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），提示NF-кB可能參與BRPS抗HUVEC細(xì)胞凋亡作用的調(diào)控。

2.7BRPS對HUVEC細(xì)胞ERK信號通路的影響

ERK是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)的信號通路[18]，BRPS對HUVEC細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)及其磷酸化蛋白p-ERK水平的影響見圖7。

圖7BRPS對HUVEC細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of BRPS on protein express of ERKs in HUVEC

由圖7可見，與正常組比較，損傷組p-ERK/ERK相對比值升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組p-ERK/ERK相對比值無顯著變化（P＞0.05），提示ERK磷酸化可能與BRPS的HUVEC細(xì)胞凋亡抑制作用無關(guān)。

2.8 BRPS對HUVEC細(xì)胞p38信號通路的影響

p38信號通路在細(xì)胞凋亡、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)等過程中具有重要作用，H2O2等多種因素均可誘導(dǎo)p38信號通路激活[19]，BRPS對HUVEC細(xì)胞p38蛋白表達(dá)及其磷酸化蛋白p-p38水平的影響見圖8。

由圖8可見，與正常組比較，損傷組p-p38/p38相對比值升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組 p-p38/p38相對比值降低（P＜0.05），提示p38磷酸化可能與BRPS抗HUVEC細(xì)胞凋亡作用的調(diào)控有關(guān)。

圖8BRPS對HUVEC細(xì)胞p38蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of BRPS on protein expression of p38 in HUVEC

2.9BRPS對HUVEC細(xì)胞JNK信號通路的影響

JNK信號通路在外源性死亡受體途徑和內(nèi)在的線粒體凋亡途徑中起關(guān)鍵作用，JNK信號通路通過特異性轉(zhuǎn)錄因子的反式激活上調(diào)促凋亡基因如p53等或調(diào)節(jié)線粒體凋亡蛋白的活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]，BRPS對HUVEC細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化蛋白p-JNK水平的影響見圖9。

圖9BRPS對HUVEC細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of BRPS on protein expression of JNKs in HUVEC

由圖9可見，與正常組比較，損傷組p-JNK/JNK相對比值升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組p-JNK/JNK相對比值降低（P＜0.05），提示JNK磷酸化可能與BRPS抗HUVEC細(xì)胞凋亡作用的調(diào)控有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，t-BHP增高HUVEC細(xì)胞凋亡，下調(diào) Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9 蛋白表達(dá)，增強其底物蛋白PARP的切割使Cleaved-PARP蛋白增多。同時，下調(diào)凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)，上調(diào)p53蛋白表達(dá)，升高JNK、p38及NF-кB蛋白的激活水平。而BRPS降低HUVEC細(xì)胞凋亡，增高Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9 蛋白表達(dá)，減少PARP的切割，上調(diào)Survivin表達(dá)，下調(diào)p53蛋白表達(dá)，并降低JNK、p38以及NF-кB蛋白的激活水平。綜上所述，BRPS抑制t-BHP引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Survivin及p53蛋白的表達(dá)，其機(jī)制可能與JNK、p38及NF-кB的調(diào)控有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。