何杰 李小燕 余覓 張維 孫建

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科610500

肺癌是一種高發(fā)病率和高病死率的惡性腫瘤,非小細(xì)胞肺癌 (non-s mall cell l ung cancer,NSCLC)約占肺癌發(fā)病率的2/3,NSCLC 分為了肺腺癌、肺鱗癌、大細(xì)胞肺癌等,其中肺腺癌占了整個(gè)肺癌人群中的絕大多數(shù)[1-2]?；煛⒎暖?、靶向治療和免疫治療是肺腺癌的主要治療策略,但由于肺腺癌早期發(fā)病隱匿,確診時(shí)部分已經(jīng)屬于晚期,患者5年生存率不足15%[3-4]。因此研究肺腺癌的病因和預(yù)后因素具有重要意義。雖然鱗狀細(xì)胞肺癌和吸煙密切相關(guān),但吸煙也極大增加了患肺腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[5]。Zeng等[6]研究表明,在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院收集2000-2012年確診或治療的肺癌患者資料中,肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型是腺癌(72.93%),吸煙女性中鱗癌比例從40.5%下降到23.7%,腺癌比例從35.7%上升到50.7%。流行病學(xué)調(diào)查顯示近年來(lái)吸煙肺腺癌患者有所增加,這可能與煙草的制造工藝導(dǎo)致了香煙的成分改變有關(guān)[7]。全世界吸煙人數(shù)眾多,這類人群患肺腺癌比例增高的原因應(yīng)該得到更多關(guān)注。

吸煙是肺癌發(fā)病的主要誘因之一,組織學(xué)上相似的肺腺癌由于是否吸煙可能具有不同的分子機(jī)制[8-9]。薛鴻等[10]研究表明香煙提取物能誘導(dǎo)A549腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬和增殖,自噬能夠進(jìn)一步促進(jìn)香煙提取物對(duì)腺癌細(xì)胞的增殖作用,這種作用可能通過(guò)基于caspase-3實(shí)現(xiàn)。Liang等[11]研究表明香煙可損傷肺組織,引起肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及其線粒體形態(tài)發(fā)生改變,并通過(guò)PINK1-Parkin信號(hào)通路導(dǎo)致肺組織線粒體自噬增強(qiáng)。自噬是真核細(xì)胞依賴溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)行降解的一個(gè)生物學(xué)過(guò)程,在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中同時(shí)發(fā)揮著抑制腫瘤和促進(jìn)腫瘤的作用[12]。而香煙可誘導(dǎo)自噬水平的上調(diào),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)腫瘤微環(huán)境中的各種應(yīng)激(如饑餓、低氧低代謝環(huán)境),從而維持腫瘤細(xì)胞的活性[13]。然而,目前尚不清楚香煙通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控肺腺癌中的自噬功能,同時(shí)自噬相關(guān)基因與吸煙肺腺癌患者的預(yù)后關(guān)系暫無(wú)相關(guān)研究。本研究基于GSE32863、GSE75037、TCGA 數(shù)據(jù)集獲取吸煙肺腺癌患者的基因芯片數(shù)據(jù),分析吸煙對(duì)于肺腺癌自噬基因的影響及自噬相關(guān)基因與吸煙肺腺癌人群的關(guān)系,旨在為吸煙導(dǎo)致的肺腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集篩選 吸煙肺腺癌患者的微陣列數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)來(lái)自GSE32863、GSE75037、TCGA 數(shù)據(jù)集,前兩個(gè)數(shù)據(jù)集均從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù) (https：//www.ncbi.nl m.nih.gov/geo/)下載,TCGA 數(shù)據(jù)集從癌癥基因組圖譜 (The Cancer Geno me Atlas,TCGA) (https：//portal.gdc.cancer.gov)下載。GSE32863、GSE75037、TCGA 數(shù)據(jù)集分別包含39、18、427 例 吸 煙 的 肺 腺 癌 患 者。 采 用Bioconductor軟件中的SVA 軟件包對(duì)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。

1.2 差異表達(dá)基因的鑒定 R 軟件中的微陣列數(shù)據(jù)的線性模型包用于識(shí)別來(lái)自吸煙肺腺癌患者的樣本和相鄰非癌肺組織的樣本之間的差異基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為調(diào)整后的P<0.05,l og FC 的絕對(duì)值>2。選擇數(shù)據(jù)集相交處的差異基因(GSE32863、GSE75037 和TCGA)進(jìn)行后續(xù)研究。R 軟件繪制熱圖。

1.3 差異基因的富集分析 使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8 (https：//david.ncifcrf.gov)進(jìn) 行 吸煙肺腺癌患者的差異基因富集分析。以人源基因?yàn)楸尘斑M(jìn)行GO 基因注釋和京都基因和基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Geno mes,KEGG)通路富集分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)是分析蛋白-蛋白之間相互作用的搜索工具,其包含了現(xiàn)有已經(jīng)證實(shí)的和可預(yù)測(cè)的蛋白互作關(guān)系的生物信息學(xué)數(shù)據(jù),利用這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以分析相關(guān)蛋白間的相互作用。選擇“Multipleproteins”輸入包括差異基因和人類自噬(http：//autophagy.l u/)基因名稱,物種選擇“Hu man”,代表蛋白間相互作用強(qiáng)度的置信度選擇“mediu mconfidence (0.400)”,得 到PPI 網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件用于識(shí)別自噬相關(guān)的中樞基因(在PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最多的前20位基因),使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Gene MANIA (http：//genemania.or g/)加以展示。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)l ung cancer explorer(http：//lce.biohpc.sw med.edu/)分析關(guān)鍵基因在吸煙肺腺癌組織和未吸煙肺腺癌組織的表達(dá)差異。

1.5 差異基因的預(yù)后分析 Kaplan-Meier Plotter(https：//k mplot.co m/analysis)是一款操作簡(jiǎn)單的在線分析基因表達(dá)量與生存數(shù)據(jù)間關(guān)系的工具,Kaplan-Meier Plotter包含多個(gè)GEO 數(shù)據(jù)集,可以識(shí)別和驗(yàn)證對(duì)預(yù)后有顯著影響的差異基因。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于微陣列和 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)分析, 使用Bioconductor中的微陣列數(shù)據(jù)的線性模型包來(lái)識(shí)別差異基因。識(shí)別差異基因的閾值為P<0.05,|log FC|>2。Bioconductor軟件中的SVA 軟件包用于GSE32863和GSE75037的批量歸一化。采用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)比較生存趨勢(shì)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的識(shí)別 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn),在GSE32863數(shù)據(jù)集中確定了71個(gè)差異基因 (36個(gè)上調(diào)和35個(gè)下調(diào)),在GSE75037數(shù)據(jù)集中確定了641個(gè)差異基因 (256 個(gè)上調(diào)和385 個(gè)下調(diào)),在TCGA 數(shù)據(jù)集中確定了4 070個(gè)差異基因 (3 096個(gè)上調(diào)和974個(gè)下調(diào))。選擇3個(gè)數(shù)據(jù)集交叉處的差異基因進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)了吸煙肺腺癌組織和癌旁肺組織之間的52個(gè)差異基因。3個(gè)數(shù)據(jù)集的差異基因均用熱圖可視化,并用維恩圖表示3個(gè)數(shù)據(jù)集交叉處的差異基因 (圖1)。表1 列出了GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中前10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的差異基因。

2.2 差異基因的富集分析 52個(gè)差異基因涉及到19個(gè)生物學(xué)過(guò)程,主要集中在細(xì)胞黏附白細(xì)胞遷移和胚胎植入;15個(gè)分子功能,主要富集在肽酶激活劑活性、鈣離子結(jié)合、膠原結(jié)合;13 個(gè)細(xì)胞組分主要富集在胞外區(qū)、蛋白胞外基質(zhì)和分泌顆粒(圖2)。

表1 GSE32863、GSE75037、TCGA 數(shù)據(jù)集中的部分差異基因

圖1 吸煙肺腺癌患者的差異基因 A：GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的GSE32863 數(shù)據(jù);B：GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的GSE75037 數(shù)據(jù);C：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的數(shù)據(jù);D：顯示3個(gè)數(shù)據(jù)集之間的52個(gè)共同差異基因的韋恩圖

KEGG 途徑富集分析 (10個(gè)KEGG 通路被顯著富集)表明大多數(shù)差異基因在IL-17信號(hào)傳導(dǎo)途徑、非洲錐蟲病、膀胱癌、自噬等途徑中富集(圖2)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 本研究構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)以了解差異基因的生物學(xué)意義。PPI網(wǎng)絡(luò)由58個(gè)節(jié)點(diǎn)和123個(gè)交互組成 (圖3),包括了自噬相關(guān)基因與差異基因之間的網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出17個(gè)差異基因是網(wǎng)絡(luò)中的中心基因。如圖4所示,有5 個(gè)與自噬基因密切相關(guān)的關(guān)鍵基因,包括LYVE1、RGCC、FOSB、ETV4、CDC20。與未吸煙的肺腺癌組織相比,LYVE1 和CDC20 在吸煙腺癌組織中均有更高的表達(dá) (P值均<0.05),見(jiàn)圖5。

2.4 Kaplan-Meier 生存分析 Kaplan-Meier Plotter發(fā)現(xiàn)網(wǎng)站中收集的GSE31210和GSE50081數(shù)據(jù)集中包含有246例患有肺腺癌的吸煙人群預(yù)后信息,Kaplan-Meier曲線用于評(píng)估自噬相關(guān)關(guān)鍵基因?qū)?46例患有肺腺癌的吸煙人群的總生存率的影響。LYVE1 和CDC20 的低表達(dá)與總生存率的改善有關(guān)(P值均<0.05),見(jiàn)圖6。

3 討論

吸煙可以導(dǎo)致肺癌發(fā)生的機(jī)率明顯升高,同時(shí)也可以影響肺癌病理類型的變化[14]。國(guó)內(nèi)外研究顯示,近年來(lái)肺癌病理類型發(fā)生了變化,吸煙導(dǎo)致的肺腺癌呈上升趨勢(shì)[15]。即便是同一種組織類型的肺腺癌,由于是否吸煙的因素,腫瘤也可能存在不同的分子機(jī)制。目前對(duì)于吸煙導(dǎo)致肺腺癌的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后因素仍然存在爭(zhēng)議。梁珍珍等[16]研究發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞在香煙提取物刺激下,自噬基因LC3表達(dá)上調(diào),IL-6、HIF1等炎癥因子的釋放水平增強(qiáng),兩者呈正相關(guān)。Szoka等[17]研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞短期暴露于香煙提取物會(huì)增加氧化應(yīng)激,導(dǎo)致自噬活性增強(qiáng)。自噬在肺癌早期通常發(fā)揮著抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,在腫瘤的進(jìn)展期,自噬可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)自噬獲取能量維持其快速增殖及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物合成、代謝的新平衡[18-20]。目前,吸煙誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)是否在肺腺癌中發(fā)揮著重要作用仍有爭(zhēng)議,也很少有研究調(diào)查自噬相關(guān)基因與吸煙的肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)合R 軟件和多種在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析了來(lái)自GSE32863、TCGA 和GSE75037數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)譜。肺腺癌和來(lái)自吸煙患者的正常肺組織樣本之間共有52個(gè)差異基因處在3個(gè)數(shù)據(jù)集的交集中。此外,與這些差異基因相關(guān)的GO 基因功能注釋和KEGG 通路也被識(shí)別出來(lái),它們可能顯著影響吸煙肺腺癌患者的預(yù)后。PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明,17個(gè)差異基因被認(rèn)為是網(wǎng)絡(luò)中的中心基因。本研究構(gòu)建了由GAPDH、MTOR、MYC 等自噬基因組成的網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因LYVE1、RGCC、ETV4、CDC20、FOSB 與自噬功能顯著相關(guān),其中LYVE1和CDC20的mRNA 表達(dá)量在吸煙肺腺癌人群中呈現(xiàn)更高的趨勢(shì)。

圖2 吸煙肺腺癌患者的差異基因GO 分析和KEGG 分析 A：生物學(xué)過(guò)程;B：細(xì)胞組分;C：分子功能;D：KEGG 通路

圖3 吸煙肺腺癌患者的差異基因蛋白相互關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖

LYVE1是存在于淋巴管的透明質(zhì)酸受體,其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸酶通過(guò)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入淋巴液中,參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成、淋巴細(xì)胞的活化和淋巴管的生成[21]。Mazzuca等[22]證明了LYVE1 的淋巴管生成活性在應(yīng)激條件下發(fā)生在人淋巴結(jié)來(lái)源的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上,并且依賴于自噬途徑的激活,LYVE1的高表達(dá)水平誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖、淋巴管生成和腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移,表明LYVE1調(diào)控的喪失是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化表型的重要步驟并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。本研究中,LYVE1高表達(dá)的吸煙肺腺癌患者的預(yù)后更差,可能因?yàn)橄銦熯M(jìn)一步刺激了自噬功能,上調(diào)了LYVE1的表達(dá),促進(jìn)了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。因此,LYVE1和自噬之間的相互作用可能在吸煙肺腺癌的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后中起重要作用。

CDC20是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子,參與有絲分裂過(guò)程,其C 末端的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白-蛋白的相互作用。其主要功能是通過(guò)調(diào)節(jié)有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/循環(huán)體的活性,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程[23]。有研究表明CDC20可以直接針對(duì)線粒體自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子LC3,并通過(guò)蛋白酶體促進(jìn)LC3 泛素化和降解,從而抑制線粒體自噬。線粒體自噬的抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白E 的上調(diào)和ROS積累,前兩者形成了肺腺癌重要的驅(qū)動(dòng)因素[24]。此外,CDC20表達(dá)水平與肺癌分化和基于鉑類的化療效果顯著相關(guān)[25]。CDC20水平可能對(duì)評(píng)估NSCLC的生存有顯著的預(yù)測(cè)潛力,與低表達(dá)相比,高CDC20表達(dá)水平與NSCLC 的不良預(yù)后顯著相關(guān),這與本研究的結(jié)果基本一致。本研究中CDC20的表達(dá)在吸煙腺癌組織中具有更高的表達(dá),且高表達(dá)的CDC20肺腺癌人群預(yù)后更差。CDC20可能是與吸煙肺腺癌發(fā)病機(jī)制和預(yù)后相關(guān)的候選分子標(biāo)志物。

但是,本研究仍有一定局限性。首先,差異基因的表達(dá)水平,吸煙對(duì)關(guān)鍵基因功能的影響以及自噬基因和差異基因之間的關(guān)系需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。其次,為確定吸煙肺腺癌患者具有的特異性自噬相關(guān)基因,需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步篩選。

圖4 吸煙肺腺癌患者的差異基因與自噬基因相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)圖

總之,本研究使用了生物信息學(xué)分析來(lái)探討吸煙患者肺腺癌的發(fā)病機(jī)制,并確定了該疾病的預(yù)后生物標(biāo)志物。此外,還研究了自噬相關(guān)基因在吸煙肺腺癌患者中的遺傳和分子效應(yīng)。本研究的結(jié)果為吸煙肺腺癌患者的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

圖5 自噬相關(guān)關(guān)鍵基因在吸煙肺腺癌和未吸煙肺腺癌中的表達(dá) A：LYVE1；B：RGCC；C：CDC20；D：FOSB；E：ETV4

圖6 LYVE1、CDC20與吸煙肺腺癌患者的生存關(guān)系 A：LYVE1；B：CDC20

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