許培宏, 唐 鳳, 王雪薇，王 歡, 李少壘, 沈建新, 江 玲, 陳 穗, 王海燕

(1.汕頭大學醫(yī)學院，2.汕頭大學醫(yī)學院機能學實驗室，3.汕頭大學醫(yī)學院病理生理學教研室，4.汕頭大學醫(yī)學院生理學教研室，廣東 汕頭 515041)

觀測不同強度電刺激對蛙腓腸肌收縮的影響是生理學和機能學實驗中的經(jīng)典項目，有的采用離體標本(invitrospecimen)，有的采用在體標本(invivospecimen)，但一般都使用間接刺激(indirect stimuli，即通過刺激支配腓腸肌的坐骨神經(jīng)引起肌肉的收縮)[1, 2]。在體標本和離體標本的實驗效果是否有不同？如將間接刺激改為直接刺激(direct stimuli，即刺激信號直接作用于肌肉)，效果是否一樣？目前尚無對此兩個問題的定量研究。本工作分別制備在體和離體蛙腓腸肌標本,并分別施以間接電刺激(通過坐骨神經(jīng)施加刺激)或直接電刺激(刺激電極用細針灸針,直接刺入腓腸肌中施加刺激)，用生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420F)實時記錄不同強度刺激對肌肉收縮的影響；后續(xù)通過自編程輔助處理分析肌肉收縮數(shù)據(jù)，對單收縮特征參數(shù)進行定量比較分析，以便對上述兩個問題作出明確回答。本工作實驗結(jié)果對于相關(guān)實驗教學和研究時標本和刺激方式的選取將有重要的指導意義。此外，給予萎縮肌肉和運動神經(jīng)纖維電刺激的方法已經(jīng)普遍應(yīng)用于臨床康復醫(yī)學，研究相關(guān)刺激參數(shù)對骨骼肌收縮特性的影響對于臨床指導肌萎縮或神經(jīng)運動纖維損傷康復將可提供有益的實驗基礎(chǔ)[3-6].

1 材料與方法

1.1 實驗動物

牛蛙，雌雄不拘，健康有活力，體重約100 g；共40只。

1.2 主要實驗儀器和試劑

常用蛙類手術(shù)器械、任氏液點滴裝置(自制)、張力換能器、鐵支架、三通管、直接刺激電針(自制)、生物機能實驗系統(tǒng)BL-420F(含硬件、軟件和配件，均購自成都泰盟軟件有限公司)、標準任氏液等。

1.3 標準任氏液的配制

按照標準任氏液的配方配制標準任氏液。溶液的配制遵照標準的操作規(guī)程，采用雙蒸水配制，當天配制當天使用[1,2,7]。

1.4 實驗裝置連接

間接刺激裝置連接(圖1A)：刺激輸出(stimulus output)通過保護電極作用于在體標本(或離體標本)的坐骨神經(jīng)；直接刺激裝置連接(圖1B): 刺激輸出通過細針灸針刺入腓腸肌，直接給腓腸肌電刺激。張力換能器與BL-420F系統(tǒng)的通道1連接。(圖1A、B)

Fig. 1 Diagram of experimental device

1.5 實驗方案

分四個組：(1)間接刺激在體標本組，簡稱在體間接組(vivo-ind，n=12)；(2)直接刺激在體標本組，簡稱在體直接組(vivo-dir，n=8)；(3)間接刺激離體標本組，簡稱離體間接組(vitro-ind，n=12)；(4)直接刺激離體標本組，簡稱離體直接組(vitro-dir，n=8)。

按常規(guī)方法分別制備蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌在體和離體標本[1,2]，之后分別對標本施加間接刺激或直接刺激，通過BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)的第1通道(channel 1)記錄由刺激引起的腓腸肌收縮張力信號。間接刺激由保護電極作用于支配腓腸肌的坐骨神經(jīng)從而引起腓腸肌收縮，而直接刺激由兩根細針灸針組成的刺激電極直接刺入腓腸肌中施加刺激。這兩種刺激電極分別連接到BL-420F實驗系統(tǒng)刺激輸出端口; 刺激輸出參數(shù)設(shè)置如下[1, 2, 8]：程控單刺激，波寬0.05 ms，延時100 ms，采樣率1 KHz，強度從0 V開始，周期3 s，增量0.02 V，最大刺激不超過3 V。實驗過程中通過自制裝置勻速滴加任氏液以保持標本活性。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用上述方案，用BL-420F所記錄的實驗數(shù)據(jù)量較多，后續(xù)可導出數(shù)據(jù)到TXT文件中，再用第三方軟件(本工作用EXCEL VBA)編程輔助對TXT文件中的數(shù)據(jù)進行批量計算，從而較快速準確實現(xiàn)對各組數(shù)據(jù)的定量處理分析，由此可獲得肌肉收縮幅度-刺激強度關(guān)系曲線并得到各組數(shù)據(jù)的閾強度、半高強度和最適強度以及最大單收縮幅度、收縮期、上升斜率等重要參數(shù)。其中，腓腸肌的收縮幅度從無到有所對應(yīng)的刺激強度，即使肌肉產(chǎn)生可測量收縮幅度的最小刺激強度，稱為閾強度；當肌肉的收縮幅度不再隨著刺激強度的增大而增大時，對應(yīng)的臨界刺激強度，即使肌肉收縮達到最大幅度的最小刺激，稱為最適刺激強度[1,2]；而當肌肉收縮達到最大收縮幅度的一半時所對應(yīng)的刺激強度，稱為半高刺激強度。數(shù)據(jù)統(tǒng)計視需要采用方差分析或t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 間接刺激對在體腓腸肌標本的單收縮影響

采用前述方法，對在體蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本施以間接刺激(屬vivo-ind組)，由此可獲得肌肉收縮幅度-刺激強度關(guān)系曲線(圖2A)。分析此幅度-強度關(guān)系曲線可知：隨著強度不斷增大，腓腸肌的收縮幅度從無到有，從小到大，增大到一定程度后不再隨著刺激強度的增大而增大，保持幅度基本穩(wěn)定不變，呈一個長尾S型曲線。在本例中，閾強度為 0.38 V(圖2A，2B中的①)；半高刺激強度為0.42 V(圖2A，2B中的②)；最適刺激強度為1.44 V(圖2A，2B中的③)。選取腓腸肌的收縮幅度達到最大的波形(如圖2B中的④)進行精細測量，可得到腓腸肌單收縮的收縮期、舒張期、收縮上升斜率等重要參數(shù)(圖2C)。

2.2 間接刺激和直接刺激對在體腓腸肌標本單收縮特性的影響

為探究在體標本中，間接刺激與直接刺激對肌肉收縮性能有何不同影響，我們采用與2.1所述相同的刺激設(shè)置方案進行實驗和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)在體蛙腓腸肌在間接刺激下(屬vivo-ind)產(chǎn)生單收縮的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度均小于在直接刺激下(屬vivo-dir)產(chǎn)生單收縮的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度(P<0.05)。(2)在體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期均大于在直接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期(P<0.05)；最大單收縮半高寬和舒張期則無明顯差異。(3)在體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率小于在直接刺激下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率(P<0.05)；但下降斜率、上升斜率/下降斜率的比值則無明顯差異(表1, 圖3)。

Fig. 2 Typical results and analysis(take one with indirect stimuli in vivo as an example)

Tab. 1 Comparison of vivo-ind and vivo-dir group )

2.3 間接刺激和直接刺激對離體腓腸肌標本單收縮特性的影響

為探究離體標本中，間接刺激與直接刺激對肌肉收縮性能有何不同影響，我們采用與2.1所述相同的刺激設(shè)置方案進行實驗和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)離體蛙腓腸肌在間接刺激下(屬vitro-ind)產(chǎn)生單收縮的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度均小于在直接刺激下(屬vitro-dir)產(chǎn)生單收縮的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度(P<0.05)。(2)離體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期均大于在直接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期(P<0.05)；最大單收縮半高寬和舒張期則無明顯差異。(3)離體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率小于在直接刺激下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率(P<0.05)；但下降斜率、上升斜率/下降斜率的比值則無明顯差異。(表2, 圖4)

Fig. 3 The effects of indirect and direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo

Tab. 2 Comparison of vitro-ind and vitro-dir group

Fig. 4 The effects of indirect and direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vitro

2.4 間接刺激對在體和離體腓腸肌標本單收縮特性的影響

為探究間接刺激下，在體標本與離體標本的肌肉收縮性能有何不同，我們比較分析了相應(yīng)的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：(1)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在間接刺激下產(chǎn)生收縮的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度均無明顯差異。(2)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在間接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮幅度、半高寬、舒張期和收縮期也均無明顯差異。(3)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在間接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮的上升斜率、下降斜率和上升斜率/下降斜率的比值也均無明顯差異(表3, 圖5)。

Tab. 3 Comparison of ind-vivo and ind-vitro group n=12)

Fig. 5 The effects of indirect stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo and in vitro

2.5 直接刺激對在體和離體腓腸肌標本單收縮特性的影響結(jié)果比較

為探究直接刺激下，在體標本與離體標本的肌肉收縮性能有何不同，我們比較分析了相應(yīng)的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：(1)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在直接刺激下產(chǎn)生收縮的閾強度、半高刺激強度和最適刺激強度均無明顯差異。(2)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在直接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮幅度、半高寬、舒張期和收縮期也均無明顯差異。(3)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在直接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮的上升斜率、下降斜率和上升斜率/下降斜率的比值也均無明顯差異(表4, 圖6)。

Tab. 4 Comparison of vivo-dir and vitro-dir group n=8)

Fig. 6 The effects of direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo and in vitro

3 討論

如前所述，本研究的目的旨在通過定量實驗數(shù)據(jù)分析探討如下兩個問題：(1)不同強度刺激對在體和離體蛙腓腸肌單收縮實驗的效果是否有不同影響？(2)如將常用的間接刺激(即通過刺激坐骨神經(jīng)引起腓腸肌收縮)改為直接刺激(即刺激信號直接作用于肌肉)，效果有無不同？

為達到此目的，我們在實驗方法上作了一定的創(chuàng)新：(1)任氏液滴加裝置：由于同一標本的實驗持續(xù)時間較長，為保證標本的活性，我們通過反復實踐自制了一套任氏液點滴裝置：利用常規(guī)輸液管，加裝一個三通管，同時同步以固定頻率和固定流量給肌肉和神經(jīng)持續(xù)滴加任氏液。此裝置可避免實驗過程中不必要的人為介入，肌肉的活性良好，提高了實驗成功率。(2)直接刺激電針：文獻中未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于直接刺激牛蛙腓腸肌引起肌肉收縮方法的報道。臨床上，有采用體表電極刺激肌肉的運用[9]，但由于牛蛙腓腸肌體積小，接觸面小，體表與人體不同，不適合使用體表電極。最終，我們借鑒有關(guān)直接刺激家兔眼輪匝肌重建肌肉性能的實驗[10]，設(shè)計研究出一套適用于牛蛙腓腸肌的直接刺激裝置：將兩枚直徑0.35 mm針灸針分別與裸露的細軟銅電線焊在一起，用電工膠布將兩枚針灸粗端針近端包裹隔離避免短路；針灸針暴露的遠端平行插入肌肉后就形成了電流回路，直接刺激肌肉，實驗證明效果良好。(3)刺激輸出和數(shù)據(jù)記錄及處理分析方面，我們將由生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420F)記錄得到的原始數(shù)據(jù)導出為文txt文件，之后再用EXCEL VBA編程輔助對txt數(shù)據(jù)文件進行統(tǒng)一規(guī)范自動化的處理分析。這樣可更高效地得到肌肉收縮相關(guān)的閾強度和最適刺激強度及肌肉單收縮曲線，且結(jié)果更精準，有利于定量比較分析。

通過統(tǒng)一規(guī)范的數(shù)據(jù)定量處理和分析比較，我們發(fā)現(xiàn)：(1)對在體標本，與直接刺激比較：間接刺激的閾強度、半高強度和最適強度均更小(P< 0.05)；最大單收縮幅度更大，收縮期更長，上升斜率更小(P<0.05)(對在體標本施加間接刺激的例數(shù)為12，施加直接刺激的例數(shù)為8)。(2)對離體標本，與直接刺激比較：間接刺激的閾強度、半高強度和最適強度也均更小(P<0.05)；最大單收縮幅度更大，收縮期更長，上升斜率更小(P<0.05)(n離體間接=8,n離體直接=8)。(3)均采用間接刺激或直接刺激時，與離體標本比較，在體標本單收縮的各項參數(shù)均無差異(P>0.05)。

上述這些結(jié)果表明，雖然間接刺激和直接刺激都可以引起肌肉收縮，但通過刺激神經(jīng)間接引起肌肉收縮的效率更高(閾強度和最適刺激強度更小，而最大單收縮幅度更大)，可能是因為間接刺激通過神經(jīng)纖維末梢、以運動單位[11,12]的形式可更方便地動員更多的肌肉纖維參與收縮，因而更敏感，收縮力也更大。在本研究(性實驗)中，只要刺激方式相同(都是間接刺激或都是直接刺激)，在體標本和離體標本對骨骼肌收縮的相關(guān)特性指標無明顯差異；但從標本制備和實驗的實施方便性方面考慮，在體標本更易制備，更方便較長時間保持其活性，更有實用優(yōu)勢；而如果要進行給藥沖洗實驗，則離體標本更有優(yōu)勢。后續(xù)在進行相關(guān)研究時，可考慮延長標本的使用時間并檢測其活性，以獲得關(guān)于在體標本和離體標本在肌肉收縮性能方面有何不同的更確切的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果對于相關(guān)實驗教學和研究時骨骼肌標本(在體或離體)和刺激方式(間接或直接)的選取有重要的指導意義，而如能在相關(guān)實驗中如本文一樣引入定量比較分析的方法則可使實驗結(jié)果更準確可信。