張曉金，張文霞，朱吉玲，羅文盼

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院，鹽城 224004；2.甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000；3.紹興文理學院，浙江 紹興 312000)

盡管人類在乳腺癌治療方面已取得重大進展，但乳腺癌仍然是最常見的癌癥之一，是全球婦女死亡的主要原因[1]。即使目前治療方法不斷進步，但是乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然處于上升態(tài)勢[2]。乳腺癌侵襲轉移是乳腺癌患者死亡的關鍵所在。目前普遍認為，乳腺癌是一種多基因、多步驟參與的復雜疾病。上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)機制一直以來都是探討惡性腫瘤轉移的熱點話題。EMT是指在特定的生理、病理狀況下，上皮細胞會暫時失去極性，表現(xiàn)出間質細胞所具有的遷移特征，即上皮細胞出現(xiàn)細胞極性喪失、黏附能力下降及細胞拉長等間質表型特征。研究表明，EMT與乳腺癌的侵襲轉移顯著相關，乳腺癌細胞通過EMT獲得轉移遷移能力，侵襲周圍或遠處組織，成為轉移性腫瘤[3]。在EMT過程中，腫瘤細胞頻繁出現(xiàn)上皮標記蛋白(E-cadherin)表達水平降低，間質標記蛋白(N-cadherin)表達水平的上調[4],因此可以把這兩種免疫標記物的表達情況作為細胞發(fā)生EMT的指標。E-cadherin具有細胞黏附及信號轉導的雙重作用，是維持上皮表型的重要黏附分子，該蛋白的缺失使細胞間的黏附下降，并促使β-連環(huán)蛋白發(fā)生易位，進一步激活相關信號通路，最終誘導N-cadherin的表達上調，E-cadherin的下調及N-cadherin的高表達與腫瘤低分化、高侵襲力密切相關[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)信號傳導通路與多種腫瘤發(fā)生密切相關。例如，有研究表明cGAS可通過檢測微核，從而在維持細胞穩(wěn)態(tài)及監(jiān)控癌癥方面發(fā)揮重要作用[6]。本實驗將構建高表達cGAS的慢病毒載體，轉染乳腺癌細胞，探討cGAS通路對乳腺癌細胞增殖、遷移能力及EMT過程的作用機制,旨在尋求調控乳腺癌發(fā)展的新靶點，為臨床乳腺癌的診斷治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

乳腺癌MCF7細胞株購于上海細胞庫；

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、兔抗人cGAS單克隆抗體(Cell Signaling)、兔抗人STING單克隆抗體(Cell Signaling)、兔抗人單克隆抗體NF-κB(Cell Signaling)、兔抗人TANK單克隆抗體(Abcam)、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(Abcam)、兔抗人N-cadherin單克隆抗體(Abcam)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG的抗體(碧云天)，MTT試劑購自美國Promega公司。cGAS載體構建及慢病毒包裝由GenePharma公司完成。

1.3 建立穩(wěn)定高表達cGAS的細胞株及分組設計

將MCF7細胞消化計數(shù)后均勻接種到12孔板中，設陰性對照組(NC組)和處理組(MCF7-cGAS)，處理組加入含cGAS的慢病毒，NC組加入等量空載慢病毒。培養(yǎng)過夜，待細胞生長達到30%～40%時，棄掉舊培養(yǎng)液，更換配置好的轉染混合液，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，更換正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后加入嘌呤霉素，篩選出穩(wěn)定高表達cGAS的細胞。

1.4 MTT檢測細胞增殖

將NC組細胞和處理組細胞消化后，接種于96孔板中，2 000 cells/well，嚴格控制細胞數(shù)目，每個孔做4個重復，分別培養(yǎng)12 h，24 h，48 h，72 h，加入MTT(5.0 g/L)50 μl/well、置入培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 μl，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值，評價細胞存活率。酶標儀490 nm波長處測定吸光度(OD)值，繪制細胞生長曲線。

1.5 Transwell 檢測細胞遷移能力

分別制備NC組和MCF7-cGAS組單細胞懸液(無血清培養(yǎng)液)，以1×105cells/ml加至24孔Transwell小室上部孔中，下部腔室中加入50 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集穿過下室并鋪展在下膜表面上的細胞，結晶紫染色，計數(shù)每個膜的遷移細胞數(shù)目，計算遷移率，遷移率(%)=(遷移細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)

1.6 Western blot檢測蛋白表達水平

取NC組及MCF7-cGAS組細胞提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度并將樣本蛋白稀釋至適宜濃度，SDS-PAGE電泳2 h，轉膜1.5 h，轉膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加二抗孵育1 h，β-actin做內參。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 構建高表達cGAS 的乳腺癌細胞系的鑒定

將對照空載體病毒和高表達cGAS慢病毒分別感染MCF7細胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達，并用嘌呤霉素篩選2周，在熒光顯微鏡下觀察，可見各組細胞GFP陽性率均在90%以上。蛋白質印跡結果也表明MCF7細胞感染后cGAS蛋白表達增高，結果表明成功構建MCF7-cGAS細胞系(圖1)。

Fig. 1 Effective lentiviral vector were transfected into breast cancer cells MCF7

2.2 cGAS高表達對MCF7細胞形態(tài)學的影響

將對照組和MCF7-cGAS組細胞分別培養(yǎng)24 h后，光學顯微鏡觀察細胞，與對照組相比，MCF7-cGAS組細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖2)。細胞形態(tài)由鵝卵石樣轉變?yōu)樗笮?，該特征為癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化的表現(xiàn)之一。

Fig. 2 Effects of cGAS over expression on morphological characteristics of MCF7 cells(×200)

2.3 cGAS高表達對乳腺癌細胞增殖能力的影響

MTT檢測結果顯示，MCF7-cGAS組細胞在12 h、24 h、48 h、72 h的OD值(分別為0.379±0.012，0.516±0.019,0.854±0.032,1.154±0.027)均顯著高于對照組細胞對應時間點的OD值(0.221± 0.009，0.383±0.017，0.648±0.024，0.904±0.019，P<0.05，圖2)。

Fig. 3 Effects of cGAS overexpression on viability of MCF7 cells n=3)

2.4 cGAS高表達對乳腺癌細胞遷移能力的影響

MCF7-cGAS細胞組在48 h的遷移率為 61.58%，明顯高于對照組的遷移率28.9%(P< 0.05，圖4)。

Fig. 4 Effects ofcGAS overexpression on migration of MCF7 cells by transwell assay(×200)

2.5 cGAS高表達對乳腺癌細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與NC組相比，MCF7-cGAS細胞組EMT標記蛋白E-cadherin的表達水平降低，N-cadherin表達水平增高(P<0.05，圖5，表2)。

Fig. 5 Expressions of E-cadherin and N-cadherin detected by Western blot

Tab. 1 Relative protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in the MCF7 cells by Western blot n=3)

3 討論

cGAS-STING信號通路最初是作為天然免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分被發(fā)現(xiàn)，其功能是檢測胞漿DNA的存在，并在反應中觸發(fā)炎癥基因的表達[7-9]。之前諸多研究主要探索cGAS在固有免疫細胞中的功能與調節(jié)機制，近年來的研究顯示cGAS在腫瘤中也發(fā)揮重要調節(jié)作用。當腫瘤細胞胞質DNA泄露后，易被cGAS識別，激活下游IFN應答[10]。Ⅰ型IFN應答能夠作為刺激腫瘤反應的關鍵誘導劑, 且其上游cGAS-STING信號通路也可以在特定階段促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在非炎性路易斯肺癌(Lewis lung cancer，LLC)小鼠模型中cGAS-STING通路激活與腫瘤生長有關[11]。本研究結果顯示，cGAS高表達后乳腺癌細胞發(fā)生上皮間質轉化，提示其在乳腺癌中可能發(fā)揮調節(jié)作用。

新近研究發(fā)現(xiàn)染色體不穩(wěn)定性通過維持腫瘤細胞對胞質 DNA 的自主反應來促進轉移。染色體不穩(wěn)定的癌細胞會產生大量DNA 碎片通過微核分泌到細胞質中，一旦細胞質內出現(xiàn) DNA 碎片，就會激活 cGAS-STING 通路，但隨后不會激活經典的 NF-κB 通路。相反，cGAS-STING 通路會激活非經典的 NF-κB 通路，促使 p52 基因的表達，使癌細胞的基因表達特征與骨髓先天性免疫細胞具有某些相似性，并且可逃避 T 細胞的追殺，抑制cGAS-STING 通路可顯著抑制癌細胞轉移[12]。cGAS-STING 信號的激活也會刺激 PD-L1 在癌細胞中表達，從而介導癌細胞的免疫逃逸[13]。Chen 等發(fā)現(xiàn)連接蛋白43和原鈣黏蛋白7介導cGAMP 通過縫隙連接從腫瘤細胞轉移到星形膠質細胞，隨后誘導IFN和NF-κB的表達, 促進腦轉移[14]。本研究中cGAS高表達后增強乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。上皮間質轉化(EMT)是腫瘤性上皮細胞向間質細胞轉化的生物學過程，是惡性腫瘤侵襲和轉移的重要步驟。例如，在關于胃癌和髓母細胞瘤的研究報道，減緩EMT進程，可抑制癌細胞侵襲[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，cGAS高表達可增加N-cadherin表達，降低E-cadherin表達，促進EMT進程，這可能是cGAS促進乳腺癌細胞侵襲的機制之一，但具體作用機制還需進一步探究。

綜上所述，本研究證實cGAS高表達可促進乳腺癌細胞EMT進程，進而促進乳腺癌MCF7的增殖和遷移能力，揭示cGAS與細胞增殖、遷移相關。在后續(xù)研究中，我們將深入探討cGAS-STING通路對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響及機制，為臨床乳腺癌靶向治療提供理論依據(jù)。