席雨鑫，溫 馨，矯立杰，魏亞新，常貴全，武 韌，孫鳳起，郝靜輝，李鴻珠

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150086)

眾所周知，糖尿病并發(fā)癥常常是糖尿病病人致死、致殘的主要原因[1]。糖尿病可誘發(fā)一系列肝臟疾病，肝纖維化是慢性肝臟疾病發(fā)展到肝硬化、肝癌的必經(jīng)階段[2]。找到抑制肝纖維化的藥物和方法是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳后新發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)氣體信號(hào)分子[3]。生理濃度范圍的H2S在機(jī)體的各個(gè)組織器官發(fā)揮著重要的生理作用[3]，例如，H2S可抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)凋亡、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、調(diào)控炎癥反應(yīng)、抗氧化、調(diào)控線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控離子通道及在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3]。據(jù)報(bào)道，H2S通過抑制肝纖維化進(jìn)而減輕肝硬化及肝癌的發(fā)生[4]。H2S是通過哪些機(jī)制抑制肝纖維化已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)C57 小鼠建立糖尿病肝纖維化模型，探討外源性H2S對(duì)糖尿病小鼠肝纖維化作用及其相關(guān)機(jī)制。以期為肝癌及肝硬化等疾病的防治提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

硫氫化鈉(NaHS)和 STZ(Sigma公司)，胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthetase, CBS)、膠原 I(collagen-I, Col-I)、膠原 III(collagen-III, Col-III)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和 β-actin 抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物和糖尿病模型建立

清潔級(jí) C57 雄性體重(22±2)g小鼠24只購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物室。將 其隨機(jī)分為3組(n=8)：(1)正常對(duì)照組(Control)：小鼠腹腔注射生理鹽水，注射時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組；(2)糖尿病模型組(HG)：按小鼠體重(150 mg/kg)一次性腹腔注射 STZ，注射體積為每只小鼠100～200 μl；(3)NaHS 處理組(HG + NaHS): 方法同組別(2)，只是糖尿病模型建立后，腹腔注射NaHS(100 μmol/L·kg·d)，每天一次，連續(xù)12周。以上3組，為防止小鼠發(fā)生低血糖休克，注射 STZ 后 24 h 內(nèi)給予20% 的葡萄糖水飲用；注射 STZ 72 h 后，于小鼠尾靜脈采血測(cè)各組小鼠空腹血糖，若空腹血糖濃度>16.7 mmol/L 則證明 I 型糖尿病大鼠模型造模成功[2]。

1.3 HE 染色

從各組小鼠肝臟右葉切取相同大小的肝臟組織，用4% 多聚甲醛磷酸緩沖液固定24～48 h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、染色、透明和封片制成普通的HE染色切片，于Olympas光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 Masson染色

上述的石蠟切片脫蠟處理至無水，用 Regaud 蘇木精染液染核 5～10 min，充分水洗，用 Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液 5～10 min，以 2% 冰醋酸水溶液浸洗片刻，1% 磷鉬酸水溶液分化 3～5 min，直接用苯胺藍(lán)液染 5 min，以 0.2% 冰醋酸水溶液浸洗片刻，最后用 95% 酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.5 Western blot 檢測(cè)

取各組肝組織，在液氮內(nèi)研磨，加入冰預(yù)冷的蛋白裂解液(l mmol/L PMSF，pH7.4)，混勻，冰浴作用 30 min；4℃，12 000 r/min，離心 30 min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法染色，測(cè)定蛋白含量；取上清加入上樣緩沖液(體積比4∶1)，100℃ 沸水中煮 5 min。各組將等量的總蛋白加入 10% SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，TBST 液清洗PVDF 膜 3 次，每次 10 min，加 5% 脫脂奶粉，37℃ 封閉 1 h 后加入相應(yīng)的一抗，4℃ 震蕩過夜。TBST 液漂洗 PVDF 濾膜 3次，每次 10 min。將膜與 TBST 稀釋的二抗孵育，室溫下振蕩 1 h，TBST液漂洗除去未結(jié)合的二抗。用 Western blue stabilized substrate for AP顯色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照，計(jì)算條帶光密度值，目的蛋白表達(dá)水平以其與 β-actin 光密度比值來表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 外源性H2S對(duì)其產(chǎn)生的關(guān)鍵酶CBS蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，Control組、HG組和HG+NaHS組的CBS表達(dá)分別為1.05±0.07、0.66±0.07和1.36± 0.06，可見與Control組比較，HG組CBS 蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)。與HG組比較，HG + NaHS組CBS 蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖1)。

Fig. 1 The expressions of CBS in different groups(n=3)

2.2 外源性H2S對(duì)肝細(xì)胞損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示，Control組肝細(xì)胞排列整齊，肝組織結(jié)構(gòu)完好；HG組肝細(xì)胞排列紊亂，肝組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，有炎性壞死和大量脂質(zhì)空泡；HG + NaHS組肝細(xì)胞損傷減輕，肝組織較完好(圖2)。

Fig. 2 The structural changes of hepatocytes in different groups(× 400，scale bar=100 μm)

2.3 外源性H2S對(duì)肝纖維化的影響

Masson染色結(jié)果顯示，Control組中央靜脈區(qū)僅少量較原纖維沉積；HG組在中央靜脈區(qū)及匯管區(qū)，有大量膠原纖維沉積；HG + NaHS組膠原纖維沉積較HG組明顯減少(圖3)。

Fig. 3 The results of Masson staining in different groups(× 400，scale bar=100 μm)

2.4 外源性H2S對(duì)Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與Control組相比，HG組Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；與HG組比較，HG + NaHS組Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01，圖4，表1)。

Fig. 4 The expression changes of Col-I, Col-III and MMP-9 in different groups(n=3)

3 討論

糖尿病是以胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，或外周組織對(duì)胰島素不敏感，引起以糖代謝紊亂為主，包括脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種全身性代謝疾病，常發(fā)生血液流變學(xué)、微循環(huán)和細(xì)胞代謝的紊亂，導(dǎo)致缺血、缺氧和組織水腫，進(jìn)而引起血管和神經(jīng)病變[1]。糖尿病會(huì)引起很多并發(fā)癥并導(dǎo)致患者死亡。例如，糖尿病可引起肝硬化進(jìn)而導(dǎo)致肝癌、糖尿病腎病是慢性終末期腎衰的主要原因、糖尿病性心肌病可引起嚴(yán)重心肌舒張和收縮障礙、嚴(yán)重糖尿病足常需要截肢、糖尿病視網(wǎng)膜炎可導(dǎo)致失明等[5]?？梢?，糖尿病并發(fā)癥對(duì)機(jī)體的損傷較嚴(yán)重。

Tab. 1 The changes of Col-I, Col-III and MMP-9 expressions in different groups n=3)

STZ通過破壞胰島 B 細(xì)胞引起血糖增加導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生，這是目前建立 I 型糖尿病模型的主要方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，按小鼠體重(150 mg/kg)一次性腹腔注射 STZ 72 h 后，小鼠空腹血糖濃度為 23.8 mmol/L>16.7 mmol/L，并且 HE 和 Masson 染色也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞外基質(zhì)沉積和膠原含量均增加，這證明糖尿病小鼠模型造模成功。

眾所周知，糖尿病可引起肝纖維化，導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞、細(xì)胞外基質(zhì)增加、膠原纖維增多和排列紊亂，進(jìn)而引起肝功能下降[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)。當(dāng)MMPs 調(diào)節(jié)功能異常時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 26 種 MMPs(MMPs-1-26)，稱為 MMPs 家族。在 MMPs 家族中，MMP-9 是最重要的蛋白水解酶之一[7]。

內(nèi)源性H2S 是一種具有廣泛生理功能的氣體信號(hào)分子，由半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate suifurtransferase, 3MST)催化作用下產(chǎn)生的[3]。CBS、CSE和3MST 的分布具有組織器官特異性，肝組織中以CBS表達(dá)為最多[8]。據(jù)報(bào)道，H2S能夠抑制肝、肺和腎纖維化，被稱為有效的抗纖維化劑[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型組(HG組)CBS蛋白表達(dá)顯著減少, 肝細(xì)胞損傷及肝纖維化均加重, Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著增加，這提示糖尿病肝纖維化的發(fā)生與內(nèi)源性CBS/H2S通路的下調(diào)密切相關(guān)。為了證明這一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)外源給予NaHS(H2S產(chǎn)生的供體)的結(jié)果表明，與糖尿病模型組比較，NaHS處理組肝細(xì)胞損傷及肝纖維化均顯著減輕，CBS 蛋白表達(dá)增加，Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著減少。這證明外源性H2S可通過降低膠原含量和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)而抑制糖尿病小鼠肝纖維化。

綜上所述，糖尿病小鼠肝纖維的發(fā)生與內(nèi)源性CBS/H2S通路的下調(diào)密切相關(guān)。外源性H2S可抑制糖尿病小鼠肝纖維化，其機(jī)制與降低膠原含量和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)相關(guān)。因此H2S有望成為治療肝硬化、肝癌的新靶點(diǎn)。同時(shí)，外源性H2S 能夠抑制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，這也為糖尿病及其并發(fā)癥的臨床防治提供新的思路。