朱梅菊，毛澤華，郭紅英, 朱洪竹, 丁孝民

(1.井岡山大學(xué)體育學(xué)院, 江西 吉安 343009; 2.井岡山大學(xué)后勤保障處, 江西 吉安 343009；3.井岡山大學(xué)繼續(xù)教育與培訓(xùn)學(xué)院, 江西 吉安 343009)

石菖蒲(acorustatarinowiiSchott)為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖, 為歷代延年、益智的要藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，屬于增力類中藥之一。研究表明：石菖蒲具有較明顯的抗運動性疲勞作用[1]。又目前大量研究證實，當(dāng)機體處于疲勞狀態(tài)時，學(xué)習(xí)記憶功能受到明顯抑制。而現(xiàn)在能有效改善疲勞機體學(xué)習(xí)記憶的藥物較少。石菖蒲及其活性成分-β-細辛醚對學(xué)習(xí)記憶影響的報道較多[2]。但石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚對疲勞機體學(xué)習(xí)記憶影響的報道較甚少。海馬自由基代謝失衡和nNOS/NO信號失調(diào)均與學(xué)習(xí)記憶下降密切相關(guān)[3-4]。為此，本研究擬運用疲勞運動方案，研究石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚對疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬自由基代謝和nNOS/NO信號的影響，為石菖蒲在運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和新的益智類藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理方法

80 只、6 周齡、清潔級的雄性SD大鼠，體重(205±19)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(動物生產(chǎn)許可證: SCXK(湘)2011-0003, 動物使用許可證: SYXK(贛)2017-0003)。實驗地點：井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部重點實驗室。分籠飼養(yǎng)，自然光照，動物房內(nèi)溫度(20±3)℃，相對濕度為(40～60)%。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后, 按完全隨機法分為正常對照組(A)、單純運動組(B)、運動+α-細辛醚低、中、高劑量組(C、D、E)、運動+石菖蒲低、中、高劑量治療組(F、G、H)，共8 組，每組10 只。石菖蒲低、中、高劑量分別按石菖蒲提取物 每公斤體重 0.12、1.20 和 4.80 g，α-細辛醚低、中、高劑量分別按α-細辛醚 每公斤體重 0.10、0.50 和 1.00 mg，ig。每只大鼠每次灌胃的體積均為2 ml，每天 ig 1 次；正常組、單純運動組以等體積生理鹽水 ig。藥物劑量換算參照文獻[5]和預(yù)實驗結(jié)果。每次灌胃時間在運動前 2 h。實驗時間10 d。

1.2 石菖蒲提取物的制備

石菖蒲1 kg，購自昆明市藥材局，由中國科學(xué)院昆明植物研究所譚寧華研究員鑒定為天南星科菖蒲屬禾草狀多年生草本植物石菖蒲(acorustatarinowiiSchott)的根莖。首先用二氧化碳超臨界萃取法提取石菖蒲揮發(fā)油。然后將藥物殘渣用95%乙醇分別熱提3次，3次提取液混合，減壓濃縮成浸膏。再將乙醇提取后的中藥殘渣用水煎煮3次，在60℃水浴中濃縮成浸膏。最后將此三者合并為石菖蒲混合提取物，放4℃冰箱保存?zhèn)溆?。石菖蒲提取物中含有?細辛醚0.357% 和5-羥甲基糠醛0.015%。

1.3 石菖蒲中α-細辛醚的分離提取

干燥的石菖蒲 15 kg，粉碎后先用超臨界CO2萃取儀提取揮發(fā)油。其殘渣用95%乙醇熱提3次，減壓蒸餾得浸膏1 kg。將浸膏溶于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取?；厥杖軇┑檬兔巡糠?00 g。用氯仿-甲醇(9∶1～1∶1)對石油醚部分進行硅膠柱色譜分離，梯度洗脫，分得4個部分(F1～F4)。F1(10 g)經(jīng)Sephadex LH-20色譜柱分離，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫，HPLC制備，得到α-細辛醚(200 mg)。α-細辛醚的純度為95%。

1.4 疲勞運動方案

疲勞運動方案按文獻進行[6]。B-H組動物進行3 d 適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練后開始10 d 的正式跑臺運動, 負荷分3級，每級跑速分別為8、15、20 m/min，第1、2級分別運動15 min，第3級運動直至大鼠無法維持跑臺預(yù)定跑速，滯留于跑道后端3次以上，使用聲波和光、電刺激驅(qū)趕仍無效，并伴有呼吸急促，腹臥跑臺等行為表現(xiàn)。正常對照組動物相同條件常規(guī)飼養(yǎng), 不參加跑臺運動。

1.5 水迷宮實驗程序

采用Morris水迷宮(淮北正華)實驗測試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮測試采用圓形水池(直徑120 cm，高60 cm)，水溫(22±1)℃，低于水面1 cm 處放置一個全透明的塑料圓形平臺(直徑10 cm，高50 cm)，迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機，計算機自動跟蹤計時并記錄大鼠游泳軌跡。水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗。

1.5.1 定位航行實驗(place navigation test, PNT) 動物購入后，進行PNT訓(xùn)練3 d。PNT訓(xùn)練即: 大鼠自由游泳15 min，使大鼠熟悉水池。然后將大鼠隨機從東、西、南、北4個入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠在2 min 內(nèi)尋找到平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency)。如果大鼠在2 min 內(nèi)未找到平臺，采集系統(tǒng)將自動關(guān)閉，潛伏期按2 min計算。然后將大鼠引到平臺上停留 15 s，2次訓(xùn)練間隔3～5 min。每只大鼠每天接受3次PNT訓(xùn)練，連續(xù)3 d。第4日進行PNT測驗，取3次潛伏期平均值作為逃避潛伏期。水迷宮測驗結(jié)束后B-H 組大鼠進行10 d跑臺運動。跑臺運動第7、8、9日，所有大鼠均需進行PNT訓(xùn)練。第10日跑臺運動結(jié)束后，所有大鼠隨后進行PNT測驗，重復(fù)3次。

1.5.2 空間位置探索實驗(spatial probe test, SPT) 用于測量大鼠對平臺空間位置的準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。每次PNT測驗結(jié)束后，撤去平臺，從同一入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠2 min內(nèi)，穿越原平臺位置的次數(shù)。

1.6 腦組織的取材

最后一次SPT測試結(jié)束后即刻，用25%烏拉坦和0.9%戊巴比妥鈉混合液按0.4 ml/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血后，冰浴中快速剝離雙側(cè)海馬(稱量), 置液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存待測。

1.7 海馬腦組織SOD、NOS活性、MDA含量測定

腦組織勻漿液的上清液制備同免疫印跡法。SOD活性，采用黃嘌呤氧化酶法；NOS活性，采用比色法；MDA含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。實驗操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書中操作規(guī)程進行。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.8 免疫印跡法(Western blot)

在冰浴上用組織勻漿器制備海馬腦組織勻漿液，用15 000 r/min、4℃低溫離心15 min，吸取其上清。再重復(fù)離心一次。用BCA法進行蛋白濃度測量。樣品蛋白用10.0% SDS-PAGE 分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液(含5.0 % 脫脂奶粉，3.0% BSA，0.1%Tween-TBS)進行非特異性封閉常溫2 h，洗滌4次，加入抗nNOS(按滴度1∶ 2 000稀釋，美國Sigma公司)，4℃過夜。0.1% Tween-TBS 沖冼5 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗HRP-IgG(按滴度1∶1 000 稀釋,北京中山生物技術(shù)有限公司)37℃孵育2 h。0.1% Tween-TBS 沖冼6 次，加入ECL試劑(化學(xué)發(fā)光劑，美國Primer公司)進行曝光，X 線片記錄影像。應(yīng)用Fluorchem V 2.0 系統(tǒng)進行吸光度測定,以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH平均吸光度的比值表示蛋白水平,進行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能比較

實驗前各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù),差異無顯著性,P均>0.05。實驗后單純運動組(B)大鼠逃避潛伏期顯著長于正常組(A)，穿越平臺次數(shù)明顯少于A組，差異具有顯著性，P均<0.01。石菖蒲及α-細辛醚中、高劑量組(D、E、G、H)大鼠逃避潛伏期分別短于B組；而穿越平臺次數(shù)分別多于B組，P均<0.01。石菖蒲低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期依次為：ED>C，P均<0.01。α-細辛醚低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期依次為：HG>F，P均<0.01。α-細辛醚低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)分別與石菖蒲低、中、高劑量組比較，差異均無顯著性，P均>0.05。E、H、A組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)，差異均無顯著性(P均>0.05，表1)。提示石菖蒲和α-細辛醚均有一定的改善疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶作用，并呈一定的劑量依賴性。

Tab. 1 Comparison of learning and memory function among groups before and after n=10)

2.2 各組大鼠海馬腦組織自由基代謝比較

各組大鼠海馬腦組織自由基代謝比較見表2?？芍簡渭冞\動組(B)海馬腦組織SOD活性明顯低于正常對照組(A), 而MDA含量明顯高于A組，均P<0.01。石菖蒲中，高劑量組(D、E)和α-細辛醚中，高劑量組(G、H)海馬腦組織SOD活性高于B組；而MDA含量顯著低于B組，P<0.01或P< 0.05。石菖蒲低、中、高劑量組海馬腦組織SOD活性依次為：H>G>F，MDA含量則相反，P均<0.01。α-細辛醚低、中、高劑量組海馬腦組織SOD活性依次為：E>D>C,，而MDA含量則相反，P<0.05或P< 0.01。α-細辛醚高劑量組大鼠海馬腦組織SOD活性低于石菖蒲高劑量組，而MDA含量則相反，P均<0.01。α-細辛醚低、中劑量組大鼠海馬腦組織SOD活性分別有低于石菖蒲低、中劑量的趨勢，而MDA含量趨勢則相反，但差異均無顯著性，P均>0.05。提示石菖蒲和α-細辛醚均具有較明顯的糾正疲勞運動大鼠海馬自由基代謝失調(diào)作用，并呈一定的劑量依賴性，且石菖蒲的效果強于α-細辛醚。

Tab. 2 Comparison of SOD activities and MDA contents in hippocampus of rats among eight groups n=10)

2.3 各組大鼠海馬腦組織NOS活性和nNOS蛋白表達比較

各組大鼠海馬腦組織NOS活性和nNOS蛋白表達水平比較見圖1和表3?？芍簡渭冞\動組(B)海馬腦組織NOS活性顯著低于正常對照組(A)，P<0.01。石菖蒲中，高劑量組(D、E)和α-細辛醚中，高劑量組(G、H)海馬腦組織NOS活性均明顯低于單純運動組(B)，P<0.01。石菖蒲及α-細辛醚低、中、高劑量組(C、D、E或F、G、H)大鼠海馬腦組織NOS活性分別依次升高，差異均有顯著性，P<0.01。α-細辛醚低、中、高劑量組海馬腦組織NOS活性分別與石菖蒲低、中、高劑量組比較，差異均無顯著性，均P>0.05。各組大鼠海馬腦組織nNOS蛋白表達水平趨勢與NOS活性的變化趨勢基本相同。提示石菖蒲和α-細辛醚均具有較明顯的提高疲勞運動大鼠海馬腦組織NOS活性和nNOS蛋白表達水平作用。

Fig. 1 nNOS protein expression in hippocampus among groups

Tab. 3 Comparison of the activities of NOS and the levels of nNOS protein expression in hippocampus among groups

3 討論

本項研究表明:石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚能明顯改善疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶和提高海馬腦組織SOD和NOS活性及nNOS蛋白表達水平，降低MDA含量，并呈一定的劑量依賴性。

由疲勞運動導(dǎo)致機體學(xué)習(xí)記憶的下降正在引起學(xué)者們的重視[7-8]。石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖。改善機體的學(xué)習(xí)記憶是石菖蒲對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用的重要方面[9]。α-細辛醚是我們課題組從云南產(chǎn)的石菖蒲中分離得到的重要活性成分。研究表明α-細辛醚能改善Fmr1基因敲除小鼠的學(xué)習(xí)記憶[10]。但有關(guān)石菖蒲及其活性成分α-細辛醚對疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其作用機制方面的報道甚少。本項研究表明石菖蒲及其活性成分α-細辛醚能明顯提高運動性疲勞大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并呈一定的劑量依賴性。

眾多研究表明過量運動會產(chǎn)生大量的自由基。自由基生成增多，打破了自由基生成和清除的動態(tài)平衡，可導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生過氧化，損傷細胞的結(jié)構(gòu)和功能[11]。海馬腦組織SOD和MDA等自由基代謝失衡與學(xué)習(xí)記憶功能下降密切相關(guān)[3]。力竭運動使腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)SOD活性下降，MDA含量增加，加重氧自由基損傷；并對學(xué)習(xí)記憶功能造成明顯損害[12]。本項研究表明：單純運動組大鼠海馬腦組織SOD活性明顯低于正常對照組，而MAD含量顯著高于正常對照組。而海馬又是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)。提示疲勞運動致機體學(xué)習(xí)記憶下降與海馬區(qū)自由基代謝失衡密切相關(guān)。有研究還表明石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚能明顯降低疲勞大鼠海馬區(qū)MDA含量，提高SOD活性，并呈一定的劑量依賴性。提示石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚阻止疲勞運動大鼠海馬自由基代謝失衡，可能是其提高疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶的重要機制之一。

一氧化氮(Nitric oxide，NO)參與血壓的維持、宿主防御、神經(jīng)傳遞、抑制血小板聚集和學(xué)習(xí)記憶等多個生理過程，并涉及心血管、中樞神經(jīng)和肌肉骨骼等系統(tǒng)的功能失調(diào)或疾病[13]。NO作為控制生理功能的重要細胞內(nèi)信使，由三種不同的一氧化氮酶合成。腦組織海馬區(qū)中神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)是合成神經(jīng)遞質(zhì)NO，進而參與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵酶[14-15]。研究表明內(nèi)源性NO不但參與空間記憶的每個階段，而且對海馬突觸可塑性起關(guān)鍵作用的ERK和CaMKII的磷酸化也有重要作用[16]。一氧化氮合成酶(NOS)或NOS激活的上游分子的破壞介導(dǎo)衰老過程中的學(xué)習(xí)記憶下降[17]。轉(zhuǎn)人P301L突變tau 基因小鼠同時出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙與全腦一氧化氮含量明顯下降的現(xiàn)象[18]。對NOS/NO信號通路的調(diào)節(jié)能改善酒精誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶下降[4]。NO化學(xué)性質(zhì)非?；顫? 半衰期很短, 難以直接檢測，故本研究以測定NOS活性來反映組織NO含量[19]。疲勞會使腦組織中NOS活性減弱[19]。疲勞運動作為一種應(yīng)激刺激,使杏仁體神經(jīng)元NOS表達減少[20]。本項研究表明B組大鼠海馬腦組織中NOS活性和nNOS蛋白表達顯著低于A組，提示nNOS/NO信號下調(diào)可能是疲勞運動導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶下降的重要作用機制之一。有研究還表明石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚能提高疲勞運動大鼠海馬nNOS蛋白表達，進而使NOS活性增強，從而改善疲勞運動大鼠的學(xué)習(xí)記憶。又研究表明石菖蒲改善學(xué)習(xí)記憶與其調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性有關(guān)[21-22]。而NO又參與海馬突觸可塑性的調(diào)節(jié)，提示對海馬nNOS/NO信號的調(diào)節(jié)可能是石菖蒲改善學(xué)習(xí)記憶的重要機制之一，有待進一步的研究。

石菖蒲和α-細辛醚改善疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用基本一致，分析這可能與本實驗選擇的劑量有關(guān)的。因為在本研究中石菖蒲中α-細辛醚的含量約為0.05%。本文對α-細辛醚的劑量選擇不是根據(jù)石菖蒲中的α-細辛醚有效含量進行選擇的，而是根據(jù)藥物作用的有效性和預(yù)實驗的結(jié)果來進行選擇的。同時也提示α-細辛醚可能是石菖蒲改善疲勞運動機體學(xué)習(xí)記憶的主要活性成分。

綜上所述，疲勞運動導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶下降與海馬自由基代謝失衡, nNOS/NO信號下調(diào)有關(guān)。石菖蒲及其活性成分-α-細辛醚具有改善疲勞運動大鼠學(xué)習(xí)記憶作用，其機制與糾正海馬自由基代謝失衡, 上調(diào)海馬nNOS/NO信號有關(guān)。為石菖蒲在運動醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供部分實驗依據(jù), 為新的益智藥研發(fā)提供新的思路。