張 欣，王瑞元

(1.南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210014；2.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核生物中的溶酶體依賴(lài)性降解途徑。正常自噬可通過(guò)降解代謝廢物或大分子有用物質(zhì)維持細(xì)胞生存和代謝再利用[1]；自噬過(guò)度激活能引起細(xì)胞異化作用增強(qiáng)或影響細(xì)胞的完整性，進(jìn)而產(chǎn)生負(fù)面效果[2]。近年來(lái)運(yùn)動(dòng)與骨骼肌自噬水平的研究備受關(guān)注。已知適度運(yùn)動(dòng)能通過(guò)增強(qiáng)自噬流進(jìn)而恢復(fù)自噬受損類(lèi)大鼠骨骼肌肌肉炎癥[3]。在細(xì)胞老化的過(guò)程中，經(jīng)常給予骨骼肌細(xì)胞自噬刺激，有益于保持肌肉正常的生理狀態(tài)[4]。但有關(guān)大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞自噬水平的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前反應(yīng)自噬水平的相關(guān)蛋白主要是Beclin1和LC3-II/I。Beclin1是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中被確認(rèn)的調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)基因，是自噬體形成過(guò)程中的必需分子，能介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡，調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟，與自噬活性密切相關(guān)[5]。自噬時(shí)，LC3-I合成后通過(guò)對(duì)本身羧基末端的甘氨酸殘基修飾剪切，與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3-II。LC3-II定位于自噬前體和自噬體，其含量與自噬泡數(shù)量成正比，LC3-II/I可用于評(píng)價(jià)自噬水平[6]。

本研究建立一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌損傷模型[7]，透射電子顯微鏡和免疫熒光共同觀察運(yùn)動(dòng)后72 h內(nèi)骨骼肌細(xì)胞的自噬情況，Western blot觀察大鼠骨骼肌Beclin1和LC3-II/I表達(dá)變化，探討一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞自噬的影響，為運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

健康雄性8周齡SPF級(jí)SD大鼠共48只，(212.19±6.64)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。于北京體育大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房每籠4只分籠飼養(yǎng)、定時(shí)訓(xùn)練，室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照/黑暗晝夜光12 h交替，自由飲水飲食。適應(yīng)性訓(xùn)練前，實(shí)驗(yàn)大鼠于屏障式動(dòng)物房正常生長(zhǎng)適應(yīng)3 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù)方案

將48只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control, C，n=8)和運(yùn)動(dòng)組(Exercise, E，n=40)。C組參與適應(yīng)性訓(xùn)練后，安靜飼養(yǎng)。E組根據(jù)運(yùn)動(dòng)后的時(shí)間點(diǎn)分為5組(n=8)：即刻組(E0)、運(yùn)動(dòng)后12 h組(E12)、運(yùn)動(dòng)后24 h組(E24)、運(yùn)動(dòng)后48 h組(E48)和運(yùn)動(dòng)后72 h組(E72)。

大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)方案：延續(xù)跑臺(tái)坡度-16°，速度16 m/min，持續(xù)運(yùn)動(dòng)90 min 導(dǎo)致比目魚(yú)肌肌纖維損傷的Armstrong離心運(yùn)動(dòng)模型[7]。動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)前，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均經(jīng)過(guò)3 d無(wú)干預(yù)喂養(yǎng)和3 d適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練。適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練跑臺(tái)坡度0°，速度16 m/min，期間確保實(shí)驗(yàn)大鼠無(wú)疲勞無(wú)損傷，第1日持續(xù)訓(xùn)練5 min；第2日持續(xù)訓(xùn)練10 min；第3日休息。第4日正式實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取樣

實(shí)驗(yàn)大鼠分別在安靜和運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h、24 h、48 h和72 h時(shí)分批處死并取材。所有大鼠取材前稱(chēng)量空腹體重，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后開(kāi)腹，腹腔靜脈抽血處死。分離并剪取比目魚(yú)肌，置于冰浴中的錫紙上，小心去除兩側(cè)肌腱和結(jié)締組織。取材過(guò)程中，盡量避免肌肉牽拉。把處理后的比目魚(yú)肌肌腹切成三段，其中一段大小為l mm×1 mm×3 mm,立即投入4℃預(yù)冷的Pon-812環(huán)氧樹(shù)脂包埋,4℃保存，用于透射電子顯微鏡觀察；剩余部分平均分成兩段，一段放OCT包埋后迅速置于液氮預(yù)冷的異戊烷快速冷凍，之后放于-80℃超低溫冰箱保存，用于骨骼肌細(xì)胞中自噬蛋白的定量熒光測(cè)定，另一段用錫紙包裹后迅速投入液氮冷凍，并于-80℃冰箱保存，待Western blot蛋白測(cè)定。

1.4 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.4.1 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌自噬體的變化 將比目魚(yú)肌1)戊二醛固定；2)鋨酸固定；3)酒精脫水；4)置換；5)純樹(shù)脂包埋；7)制備切片；8)JEM-1400透射電鏡觀察。

1.4.2 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞LC3定位(LC3單染) 1)冰凍切片制作；2)多聚甲醛浸泡并固定切片；3)免疫組化筆標(biāo)識(shí)樣本范圍；4)封閉；5)一抗孵育：除血清，LC3一抗?jié)舛?∶100，37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜；6)二抗孵育：經(jīng)過(guò)夜孵育切片PBS洗3次，每次20 min，避光條件下，LC3二抗?jié)舛?∶200，37℃孵育1 h；7)封片；8)圖像采集及分析。

1.4.3 Western blot方法測(cè)定骨骼肌細(xì)胞LC3II/I和Beclin1的蛋白含量 1)骨骼肌組織蛋白提取；2)SDS-PAGE 凝膠電泳按配方配膠；3)上樣；4)電泳；5)轉(zhuǎn)膜：；6)封閉；7)一抗孵育；8)洗膜；9)二抗孵育；10)洗膜；11)凝膠成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌自噬體形態(tài)和分布的影響

透射電子顯微鏡觀察一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成和變化見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠骨骼肌肌原纖維排列整齊，肌節(jié)有明顯的規(guī)律性和重復(fù)性。線(xiàn)粒體大小不一，均勻地分布于Z線(xiàn)兩側(cè)，肌膜下方亦有線(xiàn)粒體分布，形態(tài)多為立體長(zhǎng)線(xiàn)或卵圓形，雙層膜包裹，內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。肌纖維縱切面電鏡圖片中，很難找到典型的由雙層膜碗狀結(jié)構(gòu)形成的自噬前體或由單層膜包繞細(xì)胞器的自噬體。運(yùn)動(dòng)后即刻，大鼠骨骼肌肌原纖維出現(xiàn)明顯的牽拉性損傷，牽拉部位肌小節(jié)破壞嚴(yán)重，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，腫大并向肌膜下聚集,自噬體不明顯。運(yùn)動(dòng)后12 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷程度并未發(fā)生明顯改善，肌漿網(wǎng)管腔變大腫脹，出現(xiàn)明顯空泡化，三聯(lián)體有移位現(xiàn)象。肌原纖維間和肌膜下方均能找到內(nèi)含線(xiàn)粒體、核糖體等細(xì)胞器的自噬體，且數(shù)量相對(duì)較多。運(yùn)動(dòng)后24 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷部位肌小節(jié)逐漸恢復(fù)，肌膜下或肌原纖維間仍有自噬體出現(xiàn)，但出現(xiàn)概率低。運(yùn)動(dòng)后48 h直至72 h，電鏡視野下幾乎觀察不到自噬體存在，肌原纖維及其周邊的細(xì)胞器均與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。

Fig. 1 Skeletal muscle myofibrils of rats under high power electron microscopy

2.2 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌自噬蛋白免疫熒光的影響

為了更好的探究一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后自噬蛋白的變化，本實(shí)驗(yàn)在免疫印跡法的基礎(chǔ)上，選取對(duì)應(yīng)受試大鼠比目魚(yú)肌制作冰凍切片，通過(guò)激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)自噬蛋白LC3在骨骼肌中的數(shù)量和分布(圖2，表1)。每張切片均按照相同參數(shù)隨機(jī)采集5個(gè)視野，三組各采集3個(gè)，共計(jì)15個(gè)樣本統(tǒng)計(jì)分析(圖2見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

2.3 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌Beclin1和LC3-II/I蛋白表達(dá)的影響

一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌自噬蛋白Beclin1、LC3-II/I變化如圖3，表2所示。由圖表可以看出，一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后即刻，自噬蛋白Beclin1表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在運(yùn)動(dòng)后12 h和24 h達(dá)到峰值(P<0.01，兩時(shí)間點(diǎn)間沒(méi)有顯著性差異)，運(yùn)動(dòng)后72 h逐漸恢復(fù)至與基礎(chǔ)值無(wú)顯著性差異。自噬蛋白LC3-II/I表達(dá)具有類(lèi)似的變化趨勢(shì)，一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后即刻，自噬蛋白LC3-II/I表達(dá)顯著升高(P<0.05), 運(yùn)動(dòng)后12 h達(dá)到峰值(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)后72 h逐漸恢復(fù)至與基礎(chǔ)值無(wú)顯著性差異。

Fig. 3 Beclin1 and LC3-II/I relative protein amount changes after a high-load exercise

3 討論

本研究中，一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后即刻，完整視野下骨骼肌細(xì)胞雙層膜結(jié)構(gòu)相對(duì)較多，觀測(cè)明顯，但不排除源于損傷導(dǎo)致的細(xì)胞器雜亂無(wú)序，尤其是肌漿網(wǎng)被嚴(yán)重破壞。一般來(lái)說(shuō)，自噬初期，在自噬誘導(dǎo)信號(hào)的干預(yù)下，胞漿中形成微小的雙層膜結(jié)構(gòu)，像“碗”一樣伸縮擴(kuò)張，盡管自噬體膜形成位置尚未明確，觀點(diǎn)多集中于高爾基體[8]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[9]或線(xiàn)粒體[10]。自噬中期，雙層膜結(jié)構(gòu)持續(xù)延伸，將胞漿中的任意成分包繞入“碗”中，形成完整密閉的球狀自噬體，雙層膜結(jié)構(gòu)及其包含的線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等成分，是電鏡觀察到自噬體的標(biāo)準(zhǔn)。本研究一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后12 h，完整視野下雙層膜結(jié)構(gòu)增多，細(xì)胞器出現(xiàn)空泡化，結(jié)構(gòu)不完整或消失，推測(cè)細(xì)胞自噬已大量啟動(dòng)。自噬末期，成形后的自噬體與細(xì)胞內(nèi)的吞噬泡、內(nèi)體和吞飲泡融合，隨后自噬體內(nèi)膜被溶酶體酶降解，有用產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等，被輸送至胞漿供細(xì)胞重新利用，無(wú)用殘?jiān)慌懦黾?xì)胞外[11]。本研究一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后24 h，自噬小泡多以自噬溶酶體的形式出現(xiàn)，且自噬鏡頭相對(duì)不易捕捉，說(shuō)明骨骼肌纖維的自噬水平趨于末期的自噬溶酶體溶解和信息處理階段；運(yùn)動(dòng)后48 h完整視野下自噬體很難捕捉，電鏡圖像中可以見(jiàn)到肌原纖維損傷部位，三聯(lián)體逐漸成型；運(yùn)動(dòng)后72 h電鏡下肌原纖維超微結(jié)構(gòu)與安靜狀態(tài)下相差無(wú)異，表明一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷基本恢復(fù)。

Tab. 1 Immunofluorescence intensity of light chain 3(LC3)after a high-load n=8)

Tab. 2 Relative protein amount of Beclin1 and LC3-II/LC3-I after a high-load exercise

目前反應(yīng)自噬水平的相關(guān)蛋白主要是Beclin1和LC3-II/I。Beclin1是首例哺乳動(dòng)物中確認(rèn)自噬調(diào)節(jié)蛋白基因，能介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡，調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟，是自噬體形成過(guò)程中的必需分子。LC3是自噬標(biāo)志蛋白之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞，其表達(dá)程度與自噬活性密切相關(guān)，評(píng)價(jià)自噬水平往往通過(guò)LC3-II/I[12]。LC3-I、LC3-II是有共同基因編碼的蛋白，區(qū)別于蛋白修飾不同。有研究者讓小鼠在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)1 h或急性鈍挫傷干預(yù)，骨骼肌細(xì)胞的自噬標(biāo)志蛋白含量均明顯升高[13]。Jamart的人體肌肉活檢研究也得出相同的結(jié)論[14]。在本研究中，給予大鼠一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的變化，自噬蛋白Beclin1蛋白量在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h、24 h和48 h顯著性上升，分別至基礎(chǔ)值的1.870、2.112、2.128和1.853倍；LC3-II/I在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h和48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)運(yùn)動(dòng)前相比有顯著性差異，分別升至基礎(chǔ)值的2.783、2.972和1.581倍。說(shuō)明一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)。為進(jìn)一步探究一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞自噬體的變化，本研究通過(guò)激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)并分析自噬蛋白LC3在骨骼肌中的數(shù)量和分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后即刻，12 h、24 h和48 h，自噬蛋白LC3的熒光標(biāo)記強(qiáng)度分別顯著性高于對(duì)照組基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度的1.490、3.339、3.340和2.716倍，這與電鏡下觀察到骨骼肌細(xì)胞自噬體活躍程度和自噬蛋白檢測(cè)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)顯著誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞自噬。

運(yùn)動(dòng)對(duì)自噬的影響因素尚待確定。前期有研究報(bào)道，缺氧缺糖可誘導(dǎo)損傷肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)[15]，提示此現(xiàn)象可能與運(yùn)動(dòng)代謝特點(diǎn)有關(guān)。本研究的大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，骨骼肌長(zhǎng)時(shí)間處于急劇收縮狀態(tài)，消耗大量的能量，并產(chǎn)生大量代謝中間產(chǎn)物或有害物質(zhì)，容易造成骨骼肌內(nèi)蛋白表達(dá)障礙，損害細(xì)胞器功能，此時(shí)，細(xì)胞可以通過(guò)適當(dāng)?shù)淖允赏緩剑淌晒δ苁軗p的細(xì)胞器，代謝中間產(chǎn)物或清除有害物質(zhì)，以便細(xì)胞能有效地為機(jī)體供能。一些研究還發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌自噬激活取決于其強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間[16]。長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)自噬基因程序啟動(dòng)，自噬體表達(dá)含量上調(diào)，但一次中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)60～120 min后，自噬體的含量反而會(huì)降低[17]。這表明，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，大強(qiáng)度嚴(yán)重缺氧會(huì)增加骨骼肌中的自噬蛋白含量，短時(shí)間的低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)反而會(huì)令其恢復(fù)。本研究離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌自噬可從運(yùn)動(dòng)后即刻持續(xù)至運(yùn)動(dòng)后48 h，但該結(jié)論與已有運(yùn)動(dòng)自噬相關(guān)研究并不完全一致。其中，有研究報(bào)道，適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)干預(yù)后2～7 d，受試鼠受損肌纖維出現(xiàn)明顯的自噬現(xiàn)象，且溶酶體生化功能異?；钴S[18]；亦有研究報(bào)道，大鼠在跑臺(tái)急性運(yùn)動(dòng)30 min后，自噬蛋白LC3-II即刻升高，運(yùn)動(dòng)后3 h即能恢復(fù)至基礎(chǔ)水平[19]。推測(cè)自噬可能與運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式和干預(yù)強(qiáng)度有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白表達(dá)峰值出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后12 h和24 h，且兩時(shí)間點(diǎn)數(shù)值無(wú)顯著性差異，LC3-II/I蛋白表達(dá)峰值出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后12 h，提示，一次大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后12 h是研究自噬的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。

綜上所述，大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)骨骼肌自噬超微結(jié)構(gòu)變化，自噬蛋白表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)明確運(yùn)動(dòng)損傷誘導(dǎo)的骨骼肌功能下降研究具有重要意義。