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        一種來源嗜熱古菌的耐熱β-葡萄糖苷酶制備鳶尾苷元的工藝研究

        2020-11-27 04:45:24李麗娜
        山東化工 2020年21期

        王 仲,方 偉,董 青,李麗娜

        (1.武漢華夏理工學(xué)院,湖北 武漢 430223;2.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心,湖北 武漢 430064)

        1 緒論

        野葛花[1]是我國傳統(tǒng)藥物,為豆科植物野葛的花。主要有效成分為異黃酮類化合物,是野葛花生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物,具有解酒保肝、抗腫瘤、抗炎、抗氧化[2][3]等生物活性。異黃酮大部分以糖苷形式存在,常見如葛花苷、鳶尾苷、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷、尼泊爾鳶尾素-7-O-β-D-葡萄糖苷[2]等。其中鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷是葛花異黃酮的主要成分,但是鳶尾黃素是主要藥效活性物質(zhì)。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,簡稱BGL)[4]又稱β-D-葡萄糖苷水解酶,它屬于纖維素酶類,是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。目前從嗜熱古菌中分離出一些BGL,由于其高度耐熱穩(wěn)定性及高活性,顯示出工業(yè)化優(yōu)勢,因此日益受到人們的重視。

        2 儀器與試藥

        儀器 PHS-25 pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、BS124電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司FNA/JAN系列)、TG16-WS醫(yī)用離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)、Waters2695高效液相色譜儀

        試藥β-葡萄糖苷酶(自制)、鳶尾黃素、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷對照品(自制)、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、(以上試藥均為分析純)、乙腈(色譜級)、超純水&蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)

        3 法與結(jié)果

        3.1 HPCL法檢測鳶尾苷元[6]

        色譜條件:色譜柱:Waters sunfire C18(2.1 × 150 mm,3.5 um);柱溫40 ℃;檢測波長260 nm;進(jìn)樣量6 ul;流速0.3 ml/min。流動相:乙腈梯度洗脫。

        3.2 底物溶液和酶溶液的配置

        精密稱取鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷用pH值6.0的緩沖液定容,配置得到濃度為1 mg/mL的底物溶液,備用。

        精密稱量BGL,用pH值6.0的緩沖液定容,配置得到濃度為1 mg/mL酶溶液,離心,取上清液,0.45μm微孔濾膜過濾。酶溶液須現(xiàn)配現(xiàn)用。

        3.3 鳶尾苷元的制備方法

        取0.1mg鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷及0.5 mgBGL,加入pH6.0的緩沖液定容,在實(shí)驗(yàn)條件下反應(yīng)一定時間,反應(yīng)過程中每間隔20 min劇烈震搖10次,反應(yīng)完成后精密量取酶解液0.3ml,并加入甲醇定容至1 ml使酶失活,按3.1項(xiàng)中方法進(jìn)行HPLC檢測鳶尾苷元含量。

        3.4 單因素試驗(yàn)

        將反應(yīng)液pH值、反應(yīng)溫度、酶與底物的質(zhì)量比、反應(yīng)時間分別固定在6.0、90 ℃、5∶1、4h,以鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率為衡量指標(biāo),只改變其中一個條件進(jìn)行試驗(yàn),每個試驗(yàn)平行做3分,考察制備過程中各因素水平的影響。

        3.4.1 酶與底物質(zhì)量比

        酶與底物質(zhì)量比分別設(shè)為1∶1、2∶1、5∶1、8∶1、10∶1、20∶1進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果表明隨著酶用量增大,轉(zhuǎn)化率增大,但越往后增大的幅度逐漸變小。所以當(dāng)?shù)孜锖兔纲|(zhì)量比1∶5時轉(zhuǎn)化率最佳。

        3.4.2 反應(yīng)溫度

        反應(yīng)溫度分別為80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果表明鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率先隨著溫度的升高而升高,在90 ℃時達(dá)到最大值,后開始下降。

        3.4.3 pH值

        分別用緩沖液pH值為4.5、5.0、5.5、6.0進(jìn)行反應(yīng),測定鳶尾苷元峰面積,計算出轉(zhuǎn)化率并作圖。結(jié)果表明酶解反應(yīng)受pH值的影響不大,當(dāng)pH值為6.0時,轉(zhuǎn)化率略高于其他pH值,故確定后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時緩沖液pH值保持為6.0。

        3.4.4 反應(yīng)時間

        反應(yīng)時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果表明1.5 h內(nèi)隨著時間的延長鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率逐漸上升,1.5h后轉(zhuǎn)化率保持平緩。說明鳶尾苷元在1.5 h內(nèi)已經(jīng)反應(yīng)完全。

        3.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計[5]及結(jié)果

        以反應(yīng)溫度(A)、反應(yīng)時間(B)、底物與酶質(zhì)量比(C)三個因素為自變量,每個因素取三個水平,分別以+1、0、-1編碼,以鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值R,進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)(見表1),進(jìn)行15組試驗(yàn)(試驗(yàn)安排及檢測結(jié)果見表2)。

        表1 響應(yīng)面因素水平與編碼

        表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計及轉(zhuǎn)化率

        采用Design-Expert.V8.0軟件對表結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析,得擬合方程:R=63.33-1.50A-1.25B+5.00C-0.75 AB-0.25AC+2.25BC+0.21A2-12.29B2-23.29C2。

        方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。該模型P<0.0001,表明二次方程擬合極顯著。失擬項(xiàng)P=0.5352>0.05(不顯著),失擬項(xiàng)對純誤差沒有顯著相關(guān)性,說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾小。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9957和調(diào)整系數(shù)Adj R2=0.9879,均表明該模型擬合程度好。測量的信噪比為35.34(>4為合理),說明該模型可靠。以上統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均說明方程與實(shí)際擬合良好,該模型可用于優(yōu)化酶解鳶尾苷元的工藝條件。

        表3 回歸方程方差分析表

        從三個因素的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知,各因素影響大小的排列順序?yàn)椋旱孜锱c酶質(zhì)量比(C)>反應(yīng)溫度(A)>反應(yīng)時間(B)。由回歸方程可得出各因子交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線分析圖(見圖1)。圖中可以分析出多個自變量變化對相應(yīng)值的影響以及響應(yīng)值對不同自變量變化的敏感程度。由此同樣得到各因素影響的排列大?。篊>A>B,同樣與上述方差分析結(jié)果吻合。

        圖1 各因素兩兩交互作用對鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)圖(A溫度,B時間,C底物與酶質(zhì)量比)

        對實(shí)驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)一步解析,得到理論最佳酶解條件為:(1,-0.07,0.1)即反應(yīng)溫度85 ℃,反應(yīng)0.965 h,底物與酶質(zhì)量比1∶5.5,并且在pH為6.0時鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率最高。結(jié)合實(shí)際操作,將上述理論最優(yōu)工藝條件調(diào)整為反應(yīng)溫度85 ℃,反應(yīng)1h,底物與酶質(zhì)量比1∶5.5,并且在pH為6.0的情況下重復(fù)3此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酶解效果。結(jié)果測得平均轉(zhuǎn)化率為62.09 %,RSD=2.23%。該結(jié)果與相應(yīng)預(yù)測值62.35%接近,證明該工藝穩(wěn)定,重現(xiàn)性較好。

        4 討論

        酶解反應(yīng)完成后,我們采取的是凍存的方式,但經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn),在-20 ℃的環(huán)境中該酶依舊有一定的活性,這樣就無法考察反應(yīng)時間對鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率的影響。因此,酶解反應(yīng)結(jié)束后,立即精密量取一定量的反應(yīng)液,再加入甲醇定容,甲醇加入后會使酶完全失去活性,然后再進(jìn)行色譜檢測。

        5 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計法,優(yōu)化了β-葡萄糖水解酶轉(zhuǎn)化制備鳶尾苷元的工藝。本課題選擇的這種β-葡萄糖水解酶是來源于嗜熱古菌,該酶的反應(yīng)溫度較之普通的葡萄糖水解酶高出許多,因此轉(zhuǎn)化效率高,具有現(xiàn)實(shí)意義。通過實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該酶的轉(zhuǎn)化速率快,一般在一個小時左右就能轉(zhuǎn)化全完,且操作簡單方便,適合工業(yè)推廣。

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