王 仲，方 偉，董 青，李麗娜

(1.武漢華夏理工學(xué)院，湖北 武漢 430223；2.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北 武漢 430064)

1 緒論

野葛花[1]是我國傳統(tǒng)藥物，為豆科植物野葛的花。主要有效成分為異黃酮類化合物，是野葛花生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，具有解酒保肝、抗腫瘤、抗炎、抗氧化[2][3]等生物活性。異黃酮大部分以糖苷形式存在，常見如葛花苷、鳶尾苷、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷、尼泊爾鳶尾素-7-O-β-D-葡萄糖苷[2]等。其中鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷是葛花異黃酮的主要成分，但是鳶尾黃素是主要藥效活性物質(zhì)。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，簡稱BGL)[4]又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，它屬于纖維素酶類，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。目前從嗜熱古菌中分離出一些BGL，由于其高度耐熱穩(wěn)定性及高活性，顯示出工業(yè)化優(yōu)勢，因此日益受到人們的重視。

2 儀器與試藥

儀器 PHS-25 pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、BS124電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司FNA/JAN系列)、TG16-WS醫(yī)用離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)、Waters2695高效液相色譜儀

試藥β-葡萄糖苷酶(自制)、鳶尾黃素、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷對照品(自制)、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、(以上試藥均為分析純)、乙腈(色譜級)、超純水&蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)

3 法與結(jié)果

3.1 HPCL法檢測鳶尾苷元[6]

色譜條件：色譜柱：Waters sunfire C18(2.1 × 150 mm，3.5 um)；柱溫40 ℃；檢測波長260 nm；進(jìn)樣量6 ul；流速0.3 ml/min。流動相：乙腈梯度洗脫。

3.2 底物溶液和酶溶液的配置

精密稱取鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷用pH值6.0的緩沖液定容，配置得到濃度為1 mg/mL的底物溶液，備用。

精密稱量BGL，用pH值6.0的緩沖液定容，配置得到濃度為1 mg/mL酶溶液，離心，取上清液，0.45μm微孔濾膜過濾。酶溶液須現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.3 鳶尾苷元的制備方法

取0.1mg鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷及0.5 mgBGL，加入pH6.0的緩沖液定容，在實(shí)驗(yàn)條件下反應(yīng)一定時間，反應(yīng)過程中每間隔20 min劇烈震搖10次，反應(yīng)完成后精密量取酶解液0.3ml，并加入甲醇定容至1 ml使酶失活，按3.1項(xiàng)中方法進(jìn)行HPLC檢測鳶尾苷元含量。

3.4 單因素試驗(yàn)

將反應(yīng)液pH值、反應(yīng)溫度、酶與底物的質(zhì)量比、反應(yīng)時間分別固定在6.0、90 ℃、5∶1、4h，以鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率為衡量指標(biāo)，只改變其中一個條件進(jìn)行試驗(yàn)，每個試驗(yàn)平行做3分，考察制備過程中各因素水平的影響。

3.4.1 酶與底物質(zhì)量比

酶與底物質(zhì)量比分別設(shè)為1∶1、2∶1、5∶1、8∶1、10∶1、20∶1進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明隨著酶用量增大，轉(zhuǎn)化率增大，但越往后增大的幅度逐漸變小。所以當(dāng)?shù)孜锖兔纲|(zhì)量比1∶5時轉(zhuǎn)化率最佳。

3.4.2 反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度分別為80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率先隨著溫度的升高而升高，在90 ℃時達(dá)到最大值，后開始下降。

3.4.3 pH值

分別用緩沖液pH值為4.5、5.0、5.5、6.0進(jìn)行反應(yīng)，測定鳶尾苷元峰面積，計算出轉(zhuǎn)化率并作圖。結(jié)果表明酶解反應(yīng)受pH值的影響不大，當(dāng)pH值為6.0時，轉(zhuǎn)化率略高于其他pH值，故確定后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時緩沖液pH值保持為6.0。

3.4.4 反應(yīng)時間

反應(yīng)時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明1.5 h內(nèi)隨著時間的延長鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率逐漸上升，1.5h后轉(zhuǎn)化率保持平緩。說明鳶尾苷元在1.5 h內(nèi)已經(jīng)反應(yīng)完全。

3.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計[5]及結(jié)果

以反應(yīng)溫度(A)、反應(yīng)時間(B)、底物與酶質(zhì)量比(C)三個因素為自變量，每個因素取三個水平，分別以+1、0、-1編碼，以鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值R，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)(見表1)，進(jìn)行15組試驗(yàn)(試驗(yàn)安排及檢測結(jié)果見表2)。

表1 響應(yīng)面因素水平與編碼

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計及轉(zhuǎn)化率

采用Design-Expert.V8.0軟件對表結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：R=63.33-1.50A-1.25B+5.00C-0.75 AB-0.25AC+2.25BC+0.21A2-12.29B2-23.29C2。

方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。該模型P<0.0001，表明二次方程擬合極顯著。失擬項(xiàng)P=0.5352>0.05(不顯著)，失擬項(xiàng)對純誤差沒有顯著相關(guān)性，說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾小。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9957和調(diào)整系數(shù)Adj R2=0.9879，均表明該模型擬合程度好。測量的信噪比為35.34(>4為合理)，說明該模型可靠。以上統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均說明方程與實(shí)際擬合良好，該模型可用于優(yōu)化酶解鳶尾苷元的工藝條件。

表3 回歸方程方差分析表

從三個因素的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，各因素影響大小的排列順序?yàn)椋旱孜锱c酶質(zhì)量比(C)>反應(yīng)溫度(A)>反應(yīng)時間(B)。由回歸方程可得出各因子交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線分析圖(見圖1)。圖中可以分析出多個自變量變化對相應(yīng)值的影響以及響應(yīng)值對不同自變量變化的敏感程度。由此同樣得到各因素影響的排列大?。篊>A>B，同樣與上述方差分析結(jié)果吻合。

圖1 各因素兩兩交互作用對鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)圖(A溫度，B時間，C底物與酶質(zhì)量比)

對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步解析，得到理論最佳酶解條件為：(1，-0.07，0.1)即反應(yīng)溫度85 ℃，反應(yīng)0.965 h，底物與酶質(zhì)量比1∶5.5，并且在pH為6.0時鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率最高。結(jié)合實(shí)際操作，將上述理論最優(yōu)工藝條件調(diào)整為反應(yīng)溫度85 ℃，反應(yīng)1h，底物與酶質(zhì)量比1∶5.5，并且在pH為6.0的情況下重復(fù)3此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酶解效果。結(jié)果測得平均轉(zhuǎn)化率為62.09 %，RSD=2.23%。該結(jié)果與相應(yīng)預(yù)測值62.35%接近，證明該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

4 討論

酶解反應(yīng)完成后，我們采取的是凍存的方式，但經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)，在-20 ℃的環(huán)境中該酶依舊有一定的活性，這樣就無法考察反應(yīng)時間對鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率的影響。因此，酶解反應(yīng)結(jié)束后，立即精密量取一定量的反應(yīng)液，再加入甲醇定容，甲醇加入后會使酶完全失去活性，然后再進(jìn)行色譜檢測。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計法，優(yōu)化了β-葡萄糖水解酶轉(zhuǎn)化制備鳶尾苷元的工藝。本課題選擇的這種β-葡萄糖水解酶是來源于嗜熱古菌，該酶的反應(yīng)溫度較之普通的葡萄糖水解酶高出許多，因此轉(zhuǎn)化效率高，具有現(xiàn)實(shí)意義。通過實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該酶的轉(zhuǎn)化速率快，一般在一個小時左右就能轉(zhuǎn)化全完，且操作簡單方便，適合工業(yè)推廣。