朱會(huì)霞, 孫金旭, 高 越, 王 茜 ,姜艷超

(衡水學(xué)院,河北 衡水 053000)

1 前言

在辭海中，酵素是酶的舊稱[1]。但近年來(lái)，酵素的概念又有了新的變化[2]。根據(jù)中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布的《酵素分類導(dǎo)則》規(guī)定，酵素是由各種植物(包括各種果蔬、植物根和葉)、菌菇及動(dòng)物組織等為原料，經(jīng)乳酸桿菌、德巴利酵母、醋酸菌和芽孢桿菌等多種微生物復(fù)合發(fā)酵而成的制品[3]。酵素發(fā)酵過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生多種功能性成分[4]，如γ-氨基丁酸、β-胡蘿卜素、氨基酸、功能性低聚糖等成分，進(jìn)入人體后各自發(fā)揮相應(yīng)的生理功能。特別是γ-氨基丁酸作為有特殊生理功效的非蛋白質(zhì)氨基酸對(duì)人體尤為重要，根據(jù)中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布的《食用植物酵素》規(guī)定，酵素中γ-氨基丁酸的含量已經(jīng)成為酵素行業(yè)的一個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]。因此本研究對(duì)于提高酵素的品質(zhì)是非常必要的，具有重要的意義。

日本、美國(guó)都將γ-氨基丁酸列入食品序列并確認(rèn)其為安全物質(zhì)，2009年我國(guó)衛(wèi)生部允許γ-氨基丁酸在食品生產(chǎn)加工中適量添加使用，γ-氨基丁酸是許多降血壓食品的主成分之一[10]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有的γ-氨基丁酸能夠促進(jìn)血管擴(kuò)張，降低血壓，對(duì)心血管疾病的治療有著重要功效[11]。研究發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸能夠緩解焦慮、抑郁并且還能舒緩心情[12]；能促進(jìn)腦細(xì)胞代謝，同時(shí)還能改善腦細(xì)胞代謝活動(dòng)，恢復(fù)腦細(xì)胞功能，從而起到改善睡眠、提高記憶力的作用[13]。綜上所述，γ-氨基丁酸是一種食品級(jí)的、天然存在并對(duì)人體和動(dòng)物具有多種功效的安全物質(zhì)。本文將通過(guò)改變酵素生產(chǎn)工藝中的發(fā)酵條件進(jìn)行分析，確定不同條件對(duì)γ-氨基丁酸含量及酵素品質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將優(yōu)化水果酵素生產(chǎn)的工藝條件，提高酵素的品質(zhì)和口感，為后續(xù)酵素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，也將為其他水果酵素進(jìn)行同類研究提供經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)菌種和原輔料

德巴利酵母、植物乳桿菌、醋酸菌等均由衡水學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。試驗(yàn)材料包含枸杞、樹莓、冰片糖、單晶冰糖、低聚果糖、黃砂糖等。其中枸杞購(gòu)于衡水桃城區(qū)衡杞枸杞種植專業(yè)合作社，樹莓購(gòu)于河北長(zhǎng)益生物科技有限公司，單晶冰糖、冰片糖、黃砂糖和低聚果糖購(gòu)于衡水市桃城區(qū)新興糖酒銷售部。

2.2 試驗(yàn)方法

酵素的制備：選取枸杞、樹莓兩種鮮水果，枸杞15 kg，樹莓5 kg，清洗、除梗后破碎混合，加入輔料糖和復(fù)合的三種菌種后發(fā)酵。調(diào)配：發(fā)酵結(jié)束后的枸杞復(fù)合酵素需要過(guò)濾，然后進(jìn)行合理調(diào)配。灌裝：500nm微濾，在無(wú)菌條件下灌裝。

2.3 γ-氨基丁酸測(cè)定法

按照T/CBFIA 08003—2017規(guī)定的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、測(cè)定酵素γ-氨基丁酸含量并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[14,15]。

2.4 最佳發(fā)酵溫度和時(shí)間的確定

枸杞、樹莓兩種鮮水果清洗后按3:1的比例破碎混合，加入占水果重量30%的黃砂糖和占水果重量1%的復(fù)合菌種，在24℃、27℃、30℃、33℃、36℃溫度下分別發(fā)酵，每月測(cè)定不同發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的酵素中γ-氨基丁酸的量，共測(cè)定12個(gè)月，同時(shí)進(jìn)行感官鑒評(píng)，綜合確定最優(yōu)發(fā)酵溫度及最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

2.5 輔料糖的確定

分別加入黃砂糖、單晶冰糖、低聚果糖、冰片糖等四種輔料糖，參照上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果在33℃溫度下發(fā)酵8個(gè)月，然后測(cè)出γ-氨基丁酸的量，確定最優(yōu)的輔料糖。

2.6 單因素試驗(yàn)

德巴利酵母加入量確定：分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的德巴利酵母，參照上述實(shí)驗(yàn)條件確定出德巴利酵母最優(yōu)添加量。

植物乳桿菌加入量：分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的植物乳桿菌，參照上述實(shí)驗(yàn)條件確定植物乳桿菌的最優(yōu)添加量。

醋酸菌加入量：分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的醋酸菌，參照上述實(shí)驗(yàn)條件確定出醋酸菌的最優(yōu)添加量。

2.7 正交試驗(yàn)法

為進(jìn)一步明確酵素菌種最佳配比，優(yōu)化正交試驗(yàn)進(jìn)行分析。

表1 枸杞酵素菌種優(yōu)化正交表

2.8 品評(píng)試驗(yàn)法

采取嗅覺(jué)、視覺(jué)、味覺(jué)等感官評(píng)鑒方式對(duì)不同配比的樣液進(jìn)行評(píng)鑒。

表2 枸杞酵素感官鑒評(píng)表

2.9 酸度測(cè)定法

按照T/CBFIA 08003—2017規(guī)定的方法，測(cè)定總酸度并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.10 固形物成分比例測(cè)定法

使用阿貝折光儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量，讀數(shù)，計(jì)算樣品固形物成分比例并記錄。

3 結(jié)果與討論

3.1 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線可知y = 0.112x-0.127、R2= 0.999，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好適于后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度的確定

由圖2可知，發(fā)酵初期，γ-氨基丁酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高而增多，在30℃和33℃進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，從第6個(gè)月開始γ-氨基丁酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的増長(zhǎng)而下降。在36℃發(fā)酵時(shí)，γ-氨基丁酸的含量要比33℃時(shí)要低得多，在第8個(gè)月后隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而迅速降低，低于24℃條件下的γ-氨基丁酸的含量。因此最佳的發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為6-10個(gè)月。

圖2 時(shí)間及溫度對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

從感官評(píng)鑒分值來(lái)看(圖3)，水果酵素會(huì)隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而變得香氣濃郁、酸甜適口。在24℃和27℃下發(fā)酵制成的酵素感官評(píng)分分值相差不多，24℃條件下的酵素分值較低但后期分值增長(zhǎng)較快。30℃和33℃條件下制成的酵素分值相近，33℃時(shí)分值略高，8個(gè)月后分值變化都不大。而在36℃條件下制成的酵素因溫度過(guò)高而導(dǎo)致口感不佳，分值低于30℃時(shí)的分值而高于27℃時(shí)的分值?？芍顑?yōu)的發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為8-12個(gè)月。

圖3 發(fā)酵時(shí)間及溫度對(duì)感官評(píng)鑒的影響

從以上分析可得，γ-氨基丁酸含量在33℃下發(fā)酵第6個(gè)月時(shí)最高。而感官評(píng)分則在33℃發(fā)酵8～12個(gè)月分值變化不大。綜合以上兩個(gè)指標(biāo)及成本考慮，最佳溫度是33℃，最佳時(shí)間是8個(gè)月。

3.3 輔料糖的確定

由圖4可知，當(dāng)添加冰片糖時(shí)，γ-氨基丁酸的含量最高，為55.38 mg/L其次是黃砂糖、低聚果糖和單晶冰糖。黃砂糖也叫做金砂糖，是富含一定營(yíng)養(yǎng)元素的砂糖，除了蔗糖外還有很多天然礦物質(zhì)及微量元素。單晶冰糖除蔗糖外幾乎不含其他成分。低聚果糖是由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等幾種糖混合組成的，精制的食品級(jí)低聚果糖幾乎不含微量元素和礦物質(zhì)成分。冰片糖內(nèi)除蔗糖外還富含多種維生素、天然酸類、抗氧化物質(zhì)、礦物質(zhì)和色素調(diào)節(jié)物質(zhì)，維生素以胡蘿卜素、煙酸和葉酸為主，礦物質(zhì)則主要為鋅、鎂、銅等元素。枸杞復(fù)合酵素發(fā)酵過(guò)程是幾種微生物協(xié)調(diào)互補(bǔ)、相互協(xié)作的代謝繁殖模式，而冰片糖中含有的多種碳源、生長(zhǎng)因子和微量元素，有利于本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合菌種的發(fā)酵，促進(jìn)菌種生長(zhǎng)繁殖，并且充分利用菌種間的協(xié)同作用進(jìn)而使得植物乳桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的量較高。由此分析可知應(yīng)以冰片糖作為輔料糖最佳。

圖4 輔料糖種類對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

3.4 單因素試驗(yàn)

(1)德巴利酵母加入量的確定

由圖5可知，德巴利酵母的加入量在0.5%-2.0%范圍時(shí)，γ-氨基丁酸的含量與德巴利酵母加入量成正比，當(dāng)加入量到達(dá)2.0%，γ-氨基丁酸的含量達(dá)到最高值53.5 mg/L。在隨后的三個(gè)濃度中，γ-氨基丁酸的含量則隨著加入量的增多而減少。由此可知最優(yōu)加入量應(yīng)處于1.0%-3.0%之間。

圖5 德巴利酵母加入量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

(2)植物乳桿菌加入量的確定

由圖6可知，當(dāng)植物乳桿菌加入量加入量為1.0%時(shí)，γ-氨基丁酸的含量最多，達(dá)到54.8 mg/L。當(dāng)植物乳桿菌加入量在1.5%-3.5%范圍時(shí)，γ-氨基丁酸的含量則會(huì)隨著植物乳桿菌加入量的增多而逐漸減少。由此可知最優(yōu)加入量范圍為0.5%-1.5%。

圖6 植物乳桿菌加入量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

(3)醋酸菌加入量的確定

由圖7可知，當(dāng)醋酸菌加入量為1.0%時(shí)，γ-氨基丁酸的含量最多，達(dá)到56.1 mg/L。當(dāng)醋酸菌加入量在1.5%-3.5%范圍內(nèi)時(shí)，γ-氨基丁酸的含量則會(huì)隨著醋酸菌加入量的增多而逐漸減少。由此可知最優(yōu)加入量的范圍為0.5%-1.5%。

圖7 醋酸菌加入量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

3.5 菌種正交試驗(yàn)結(jié)果

水果酵素菌種選擇植物乳桿菌、醋酸菌、德巴利酵母三種，不同的菌種配比γ-氨基丁酸的含量不同(表3)。

表3 酵素菌種試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，不同配比菌種的添加根據(jù)R值對(duì)比各因素的影響大小，結(jié)果為B>A>C(植物乳桿菌>德巴利酵母>醋酸菌)，植物乳桿菌對(duì)γ-氨基丁酸的含量影響最大，其次是德巴利酵母、醋酸菌。分析K值能夠得出幾種菌種的最優(yōu)組合是A2B3C2，即德巴利酵母的加入量應(yīng)為2.0%，植物乳桿菌的加入量為1.5%，醋酸菌的加入量應(yīng)為1.0%。但A2B3C2組合并未在正交實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)，因此需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)A2B3C2組合的γ-氨基丁酸含量為71.35 mg/L，高于正交實(shí)驗(yàn)中最高量68.72 mg/L，說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合確為γ-氨基丁酸含量最高的菌種配比。由表4方差分析結(jié)果可得，植物乳桿菌對(duì)復(fù)合酵素的影響最為顯著，德巴利酵母和醋酸菌兩種菌種對(duì)γ-氨基丁酸的含量幾乎沒(méi)有影響。

表4 因素方差分析

3.6 產(chǎn)品指標(biāo)

根據(jù)T/CBFIA 08003—2017，取50 ml樣品于干燥潔凈的樣品杯中，置于非直射日光下，用目測(cè)觀察外觀及色澤，鼻嗅其氣味。制得的水果酵素外觀顏色為黃棕色，色澤艷麗，香氣濃郁，產(chǎn)品均勻，爽口柔和。

根據(jù)T/CBFIA 08003—2017，可溶固形物(20℃折光計(jì)法)成分比例為21%；總酸(以檸檬酸計(jì))成分比例為0.7%。

4 結(jié)論

現(xiàn)代的果蔬酵素發(fā)酵流程，是將新鮮的水果以及蔬菜經(jīng)過(guò)洗凈、破碎后添加相應(yīng)輔料，在特定溫度下發(fā)酵，最后檢測(cè)調(diào)配灌裝。故研究生產(chǎn)工藝要從發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、輔料糖種類及菌種比例的確定等關(guān)鍵因素進(jìn)行研究。通過(guò)設(shè)置不同的發(fā)酵溫度和時(shí)間，依據(jù)γ-氨基丁酸含量、感官評(píng)分確定發(fā)酵溫度為33℃、發(fā)酵時(shí)間為8個(gè)月，最佳的輔料糖為冰片糖。正交實(shí)驗(yàn)確定德巴利酵母、植物乳桿菌和醋酸菌的加入量分別為2.0%、1.5%和1.0%。在此條件下，γ-氨基丁酸含量達(dá)到71.35mg/L，水果酵素色澤艷麗、具有枸杞和樹莓特有的香氣。

本研究提高了γ-氨基丁酸的含量和酵素的品質(zhì)，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他水果酵素進(jìn)行同類研究提供經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)支持。