段麗 王莉莉 馮雪 王冠 邢焱玲 孫杰 顏瑩

卵巢癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤，患者存活幾率較低。卵巢癌常用的主要治療手段包括手術(shù)輔助化療和放療。近年來，盡管卵巢癌的治療手段和措施有了很大改進(jìn)，但卵巢癌依然具有很高的死亡率。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，挖掘治療卵巢癌的有效新型靶點(diǎn)受到許多研究者的關(guān)注[1]。細(xì)胞過度增殖與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，細(xì)胞周期發(fā)生異常調(diào)控常導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)過度增殖現(xiàn)象。在細(xì)胞生命周期中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinases 6，CDK6）是哺乳動物細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，在人類大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞中均過度表達(dá)，一直受到研究者的關(guān)注[2]。研究表明，早期卵巢癌發(fā)生和發(fā)展常伴隨著CDK6 的過度表達(dá)，CDK6基因被靶向抑制后，人卵巢癌細(xì)胞的增殖和粘附能力能夠獲得有效抑制[3]。本研究擬進(jìn)一步探討CDK6 被靶向抑制后，人卵巢癌細(xì)胞凋亡水平的變化，以期為挖掘卵巢癌的基因治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910 株購買自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。CDK6 基因shRNA 表達(dá)載體由獸醫(yī)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存和鑒定，CDK6 基因和β-actin 基因擴(kuò)增引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成。FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光RT-PCR 試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分別購自德國Roche 公司、美國AB 公司和南京凱基生物。CDK6 基因的shRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計(jì)，PGPU6/GFP/CDK6-608（shRNA-608）和無關(guān)序列PGPU6/GFP/shNC（shNC）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。本研究經(jīng)過黑龍江省醫(yī)院倫理委員會審查和批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 CDK6-shRNA 轉(zhuǎn)染人卵巢癌HO-8910 細(xì)胞 將卵巢癌HO-8910 細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期狀態(tài)時，接種24 孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞密度為5×105/mL，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右融合時，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書中的步驟，把重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，一起轉(zhuǎn)染HO-8910 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分3 組：未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞對照組（未轉(zhuǎn)染組）、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞組（shNC 組）、陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組（shRNA-608 組）。

1.2.2 RT-PCR 檢測CDK6 mRNA 表達(dá) 在轉(zhuǎn)染后48 h 時，進(jìn)行細(xì)胞收集，根據(jù)細(xì)胞RNA 提取試劑盒的說明書，分別提取各組試驗(yàn)細(xì)胞的總RNA。根據(jù)熒光定量RT-PCR 說明書進(jìn)行CDK6 基因的反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增，用β-actin 作為內(nèi)參對照，β-actin 基因引物和CDK6 基因的引物參考文獻(xiàn)[3]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞消化后，制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×105/mL，按照試劑盒說明書進(jìn)行處理，避光室溫孵育10 min，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 熒光表達(dá)觀察 使用熒光顯微鏡觀察未轉(zhuǎn)染組、shNC 組、shRNA-608 組細(xì)胞是否有熒光表達(dá)。

1.3.2 RT-PCR 檢測CDK6 mRNA 表達(dá) 使用RT-PCR 方法檢測3 組細(xì)胞CDK6 基因的表達(dá)情況。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡 使用流式細(xì)胞儀分別檢測各組細(xì)胞凋亡的情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究中涉及3 組間的分析，采用單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，當(dāng)P＜0.05 時，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光觀察結(jié)果

無關(guān)序列組及shRNA-608 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均觀察到綠色熒光，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80%，而未轉(zhuǎn)染空白組細(xì)胞無熒光表達(dá)。

2.2 shRNA 抑制CDK6 基因mRNA 表達(dá)結(jié)果

應(yīng)用熒光定量RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染48 h 時細(xì)胞CDK6 mRNA的相對表達(dá)情況，為避免操作等因素引起的差異，每組均設(shè)3個重復(fù)細(xì)胞孔，進(jìn)行RNA 檢測。結(jié)果顯示，與shNC 組和空白對照組比較，shRNA-608 組CDK6 mRNA 表達(dá)顯著被抑制（P ＜0.001），抑制率為（48.15±0.59）%；shNC 組與未轉(zhuǎn)染組比較，CDK6 mRNA 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.724），見表1。

2.3 CDK6-shRNA 對細(xì)胞凋亡能力的影響

本試驗(yàn)采用AnnexinV／PI 雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測不同試驗(yàn)組卵巢癌細(xì)胞的凋亡情況，為避免操作等因素引起的差異，設(shè)3個重復(fù)細(xì)胞孔，進(jìn)行凋亡檢測。結(jié)果顯示，shRNA-608 組卵巢癌細(xì)胞的凋亡率為（47.63±0.81）%，與shNC 組相比，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001），shNC 組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞之間相比，細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.080），見表2。

3 討論

目前臨床上缺乏卵巢癌有效的早期篩查和診斷方法，多數(shù)患者被診斷為卵巢癌時已處于晚期，常以死亡轉(zhuǎn)歸。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和輔以化療是卵巢癌治療的主要方式，但部分患者治療后出現(xiàn)化療耐藥，病情進(jìn)一步惡化或者復(fù)發(fā)，挖掘有效的藥物治療靶點(diǎn)，成為卵巢癌研究的熱點(diǎn)。癌癥的典型生物學(xué)特征是細(xì)胞周期紊亂。CDK 是細(xì)胞周期關(guān)鍵基因，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CDK6 基因在多種腫瘤中過表達(dá)[4-5]。凌晨等發(fā)現(xiàn)CDK6 在早期卵巢癌中表達(dá)促進(jìn)了早期卵巢癌發(fā)生發(fā)展[6]，羅小鵬等發(fā)現(xiàn)抑制CDK6 可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化[7]。我們在前期研究中，也發(fā)現(xiàn)抑制CDK6 基因后，卵巢癌細(xì)胞的增殖和粘附能力也明顯受到抑制[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制卵巢癌細(xì)胞CDK6 基因?qū)@著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步提示CDK6 可以作為藥物靶點(diǎn)的可能性。

表1 各組CDK6 mRNA 的抑制情況

表2 各組卵巢癌HO-8910 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

利用RNA 干擾技術(shù)進(jìn)行腫瘤治療已受到極大關(guān)注[7-8]。Yan 等通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA 方式，成功敲除UHRF1 基因后，HO-8910 細(xì)胞的凋亡顯著促進(jìn)、細(xì)胞增殖顯著受到抑制、腫瘤細(xì)胞侵襲能力顯著降低[9]。本研究使用shRNA 技術(shù)也發(fā)現(xiàn)CDK6 基因的抑制顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡?；贑DK6 基因在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程中的重要作用，一系列CDK 的抑制劑已經(jīng)完成臨床研究，部分抑制劑已上市應(yīng)用于臨床治療。目前已有多種用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的CDK6 抑制劑通過了美國食品藥品管理局（FDA）的批準(zhǔn)[10-11]。CDK6 抑制劑通過調(diào)控細(xì)胞周期，改變腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)等多個機(jī)制來有效對抗惡性腫瘤。與同樣作用于細(xì)胞周期的其他腫瘤抑制劑相比，CDK6 抑制劑在安全性方面具有優(yōu)勢，為惡性腫瘤的治療帶來希望[12]。

綜上所述，CDK6 對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要，有望作為腫瘤治療的靶向基因。