山雨思 辛正琦 何 瀟 代歡歡 吳能表,*

外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下顛茄生物堿積累及TAs代謝途徑調(diào)控的機(jī)制探究

山雨思1,2辛正琦1,2何 瀟1,2代歡歡1,2吳能表1,2,*

1西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715;2三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715

以顛茄(L.)為材料, 采用外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)處理顛茄幼苗, 研究UV-B脅迫下不同濃度外源MeJA在不同處理時(shí)間對(duì)顛茄托品烷類生物堿(tropane alkaloids, TAs)含量、TAs合成途徑上游產(chǎn)物、信號(hào)分子以及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響, 初步探究UV-B脅迫下外源MeJA調(diào)控顛茄TAs代謝途徑的機(jī)制。UV-B脅迫顯著降低了顛茄莨菪堿和東莨菪堿的含量, 對(duì)TAs合成途徑前體物質(zhì)的積累產(chǎn)生抑制作用, 不利于TAs合成代謝。經(jīng)適宜濃度的MeJA處理后, 顛茄TAs含量有一定程度的提高, 次生代謝途徑中前體氨基酸(鳥氨酸和精氨酸)、多胺含量以及腐胺合成關(guān)鍵酶活性也均有不同程度的上升; 信號(hào)分子NO的濃度隨MeJA濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì), 在MeJA濃度為250 μmol L-1時(shí)達(dá)到最高。對(duì)TAs合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 在外源MeJA的誘導(dǎo)下, 顛茄葉片和根部、、表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)。表明外源MeJA通過誘導(dǎo)顛茄TAs合成上游產(chǎn)物含量的升高, 刺激NO的迸發(fā), 為TAs合成途徑提供更多的前體物質(zhì), 同時(shí)通過調(diào)控TAs代謝途徑中關(guān)鍵酶基因、與的高效表達(dá), 有效緩解UV-B脅迫對(duì)顛茄TAs的抑制作用, 提高顛茄莨菪堿和東莨菪堿的含量。以上研究結(jié)果可為今后進(jìn)一步研究逆境脅迫下外源誘導(dǎo)子調(diào)控顛茄TAs次生代謝途徑機(jī)制提供依據(jù), 以期在實(shí)際生產(chǎn)中有效提高顛茄的抗逆性和其藥用成分的積累。

茉莉酸甲酯; UV-B脅迫; 顛茄; 托品烷類生物堿; 次生代謝

顛茄(L.)又稱“野山茄”、“顛茄草”, 是茄科顛茄屬的多年生草本植物, 全草可入藥, 因含有莨菪堿和東莨菪堿而成為托品烷類生物堿(tropane alkaloids, TAs)藥源植物[1]。莨菪堿和東莨菪堿是一類重要的抗膽堿藥物, 在臨床上廣泛用于麻醉、鎮(zhèn)痛、抗暈動(dòng)病、控制帕金森病的僵直和震顫等[2-3]。但顛茄中的TAs含量極低, 且市場(chǎng)需求量巨大。因此研究如何提高顛茄TAs的含量具有十分重要的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。

近年來, 由于氟氯烴等化合物排放的增加, 導(dǎo)致地球臭氧層變薄甚至出現(xiàn)空洞, 過量的UV-B輻射到達(dá)地表, 對(duì)生物尤其是以光為能源的植物造成很大影響[4]。研究表明, 臭氧量每減少1%, 地球表面的UV-B輻射強(qiáng)度就將增加2%, 因此, 研究UV-B輻射脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響具有極其重要的意義[5]。UV-B作為一種環(huán)境脅迫不僅導(dǎo)致植物DNA損傷、細(xì)胞死亡及生長(zhǎng)受抑制, 同時(shí)會(huì)影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成[6]。盧克歡等[4]研究發(fā)現(xiàn), 中、高強(qiáng)度UV-B輻射顯著降低顛茄葉片和莖中莨菪堿和東莨菪堿的含量, 不利于顛茄TAs的積累。

茉莉酸甲酯(MeJA)是一種芳香類的揮發(fā)性化合物, 最早發(fā)現(xiàn)于茉莉?qū)偎剀盎ㄖ? 作為一種重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)劑, 參與植株發(fā)育的不同過程, 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用[7], 在植物次生代謝產(chǎn)物的生成和基因表達(dá)中也發(fā)揮著重要的作用[8]。楊怡等[9]研究發(fā)現(xiàn), 適宜濃度的MeJA可通過提高顛茄葉片和根部相關(guān)基因的表達(dá)量, 促進(jìn)莨菪堿和東莨菪堿的合成, 提高顛茄TAs的含量。此外, MeJA作為一種信號(hào)分子, 廣泛參與植物在生物與非生物脅迫中的抗逆反應(yīng), 如病蟲害、UV-B、干旱、高溫等脅迫[10]。植物在逆境脅迫條件下, 內(nèi)源茉莉酸及茉莉酸甲酯含量增加, 激活自身防御系統(tǒng), 誘導(dǎo)相關(guān)防御基因的表達(dá), 合成防御物質(zhì), 增強(qiáng)植物的抗逆性[11]。Fedina等[12]通過對(duì)早熟禾的研究發(fā)現(xiàn), 外源施加茉莉酸甲酯能提高早熟禾的抗氧化酶活性, 以緩解UV-B輻射的傷害。郭玉梅[13]研究發(fā)現(xiàn), 外源添加適宜濃度的茉莉酸甲酯能通過提高鐵皮石斛苗的光合色素含量、保護(hù)酶活性和主要活性成分含量, 緩解UV-B輻射的傷害。目前已有許多關(guān)于MeJA在提高植物對(duì)逆境適應(yīng)性以及次生代謝調(diào)控方面的研究, 但關(guān)于外源MeJA緩解UV-B脅迫對(duì)植物傷害的研究仍然屈指可數(shù)。

本試驗(yàn)以顛茄實(shí)生苗為材料, 分析UV-B脅迫下不同濃度外源MeJA不同處理時(shí)間對(duì)顛茄TAs含量的變化規(guī)律, 探究外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄次生代謝上游產(chǎn)物、信號(hào)分子以及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響, 初步探討外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄次生代謝的調(diào)控機(jī)制, 以期為實(shí)際生產(chǎn)中解決顛茄批量栽培中可能遇到的UV-B脅迫問題提供一定的理論依據(jù), 同時(shí)對(duì)于提高顛茄托品烷類生物堿含量也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

顛茄種子購(gòu)自湖南永州, 經(jīng)西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳能表教授鑒定為顛茄(L.)。挑選顆粒飽滿的顛茄種子浸泡于50 mg L-1的赤霉素溶液中, 2 d后取出, 然后用蒸餾水反復(fù)漂洗干凈, 置于濕潤(rùn)濾紙上于25℃溫室內(nèi)萌發(fā)。待萌發(fā)后移栽至盛有混勻介質(zhì)(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石= 3∶1∶1)的營(yíng)養(yǎng)盆(12 cm × 13 cm)中, 每盆3株, 共300盆。幼苗生長(zhǎng)條件的室內(nèi)晝/夜溫度為25℃/20℃, 光強(qiáng)為62.5 μmol m-2s-1, 光照時(shí)間為12 h d-1, 相對(duì)濕度為60%~70%。每7 d澆灌1次稀釋10倍的MS營(yíng)養(yǎng)液, 2個(gè)月后, 挑選200盆長(zhǎng)勢(shì)一致的顛茄幼苗, 開始試驗(yàn)處理。參照蘇貝貝[14]的研究并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果最終確定UV-B脅迫所用的輻射強(qiáng)度為10 μW cm-2, 設(shè)50 (T1)、150 (T2)、250 (T3)和350 (T4) μmol L–14個(gè)MeJA溶液濃度梯度, 每天采用相同強(qiáng)度的UV-B照射1 h, 同時(shí)葉片噴施1次對(duì)應(yīng)濃度的MeJA溶液至欲滴。

分別在第4、8、12和16 d時(shí)采集顛茄葉片作為待測(cè)樣品, 存放于-80℃冰箱進(jìn)行低溫保存, 用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。采集顛茄根、葉組織材料, 一部分凍存于液氮中, 用于基因表達(dá)量的測(cè)定; 另一部分于60℃烘箱中烘干至恒重, 用于生物堿含量的測(cè)定。每處理組設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目

1.2.1 托品烷類生物堿的提取與含量測(cè)定 參照Z(yǔ)árate等[15]方法提取的樣品液用0.22 μm濾膜過濾, ?4℃保存?zhèn)溆?。采用HPLC測(cè)定莨菪堿、東莨菪堿含量。色譜儀為日本島津(Shimadzu) LC-60A高效液相色譜儀(泵: LC-20AD, 控制器: SPD-20A, 柱溫箱: CTO-10AS vp); 色譜柱為Xtimate XB-C18液相色譜柱(5 μm, 4.6 mm × 250.0 mm); 流動(dòng)相為甲醇∶醋酸緩沖液(20 mmol L-1醋酸銨, 0.1%甲酸, pH 4.0) = 1∶4; 檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm; 流速1.0 mL min-1; 柱溫40℃; 進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 鳥氨酸和精氨酸含量的測(cè)定 參照黃愛清等[16]的方法測(cè)定鳥氨酸含量, 參照胡桂娟等[17]的方法測(cè)定精氨酸含量。

1.2.3 鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)和精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase, ADC)活性的測(cè)定 參照趙福庚等[18]的方法, 使用紫外分光光度計(jì)(日本島津 UV-2250)測(cè)定ODC和ADC的活性。以每克組織在每毫升反應(yīng)體系中每小時(shí)使254 nm下的吸光度變化1為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 多胺提取與含量的測(cè)定 參照康朵蘭[19]的方法提取并甲?；~片中的游離多胺, 樣品液用200 μL甲醇溶解, 過0.45 μm濾膜待測(cè)。采用HPLC測(cè)定多胺的含量。色譜儀為日本島津(Shimadzu) LC-60A高效液相色譜儀(泵: LC-20AD, 控制器: SPD-20A, 柱溫箱: CTO-10AS vp); 色譜柱為Xtimate XB-C18液相色譜柱(5 μm, 4.6 mm × 250.0 mm); 流動(dòng)相為甲醇∶水=64∶36; 檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm; 流速0.7 mL min-1; 柱溫30℃; 進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 一氧化氮含量的測(cè)定 采用總一氧化氮檢測(cè)試劑盒(S0023) (碧云天), 通過酶標(biāo)儀(Infinite F50)測(cè)定一氧化氮(NO)含量。

1.2.6 TAs合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的檢測(cè)

按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒使用說明提取總RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)說明書反轉(zhuǎn)錄顛茄根、葉RNA, 合成用于熒光定量所需的cDNA模板。參照NCBI上公布的序列及強(qiáng)瑋等[20-21]的引物序列設(shè)計(jì)、、和基因引物, 參照Qiu等[22]的引物序列設(shè)計(jì)基因引物, 由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板, 使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。以為內(nèi)參基因, 內(nèi)參和樣本基因分別設(shè)3個(gè)重復(fù)和1個(gè)陰性對(duì)照, 均以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量, 采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR所需引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片TAs含量的影響

由表2可知, 在UV-B脅迫處理下, CK2組的莨菪堿含量較CK1組在第4天時(shí)有一定程度的提高, 而在處理至第8、12、16 d, 其莨菪堿含量隨UV-B處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)降低, 處理至16 d時(shí), 其含量較CK1組降低了39.68%; 而東莨菪堿含量在各個(gè)處理時(shí)期均顯著下降。說明短期(4 d) UV-B脅迫可以促進(jìn)顛茄莨菪堿的積累, 但中長(zhǎng)期(8 d、12 d、16 d) UV-B脅迫顯著抑制了顛茄托品烷類生物堿的積累。外施不同濃度MeJA處理后, 在相同處理時(shí)間下, 莨菪堿與東莨菪堿的含量變化趨勢(shì)一致, 較CK2組均有所提高, 且二者含量均隨著MeJA濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì), 其中以T3組的處理效果最好,總生物堿含量顯著高于其他處理組, 處理至16 d時(shí), T3組的莨菪堿與東莨菪堿含量較CK2組分別顯著提高了30.37%和52.60%。表明外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下東莨菪堿含量的影響更大, 250 μmol L-1的MeJA可有效促進(jìn)UV-B脅迫下顛茄莨菪堿向東莨菪堿的轉(zhuǎn)化?？傮w而言, UV-B脅迫不利于顛茄莨菪堿與東莨菪堿的積累, 而外源施加MeJA可以有效緩解UV-B脅迫對(duì)TAs積累的抑制, 以250 μmol L-1的MeJA處理效果最好。

表2 不同濃度外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片莨菪堿和東莨菪堿含量的影響

表中同一列數(shù)據(jù)的不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T4分別代表UV-B脅迫下不同濃度MeJA處理組, 分別是50 μmol L–1、150 μmol L–1、250 μmol L–1、350 μmol L–1。CK1表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。CK2表示只進(jìn)行UV-B脅迫處理。

Different lowercase letters within the same column in the table show significant difference at< 0.05. T1 to T4 indicate different treatments of MeJA concentration at 50 μmol L–1, 150 μmol L–1, 250 μmol L–1, and 350 μmol L–1under UV-B stress. CK1: untreated blank control groups. CK2: UV-B stress treatment.

2.2 外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片鳥氨酸和精氨酸含量的影響

圖1為測(cè)定處理16 d時(shí)顛茄各處理組中鳥氨酸和精氨酸的含量。UV-B脅迫下, 顛茄葉片鳥氨酸和精氨酸含量均顯著下降, 分別較CK1組降低了53.46%和67.55%。經(jīng)不同濃度的MeJA處理后, 二者含量變化趨勢(shì)相似, 均隨著MeJA濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)MeJA濃度為250 μmol L-1時(shí)處理效果最好, 與CK2組相比, 二者含量均達(dá)到最大值, 分別是CK2組的1.53倍和1.69倍(圖1)。表明適宜濃度的MeJA可有效緩解UV-B脅迫對(duì)顛茄葉片中鳥氨酸和精氨酸含量的抑制作用。

2.3 外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片ODC和ADC酶活性的影響

鳥氨酸脫羧酶(ODC)和精氨酸脫羧酶(ADC)分別催化鳥氨酸和精氨酸生成TAs合成途徑中的前體物質(zhì)腐胺, 這2種酶的活性影響腐胺的積累。為明確UV-B脅迫下茉莉酸甲酯對(duì)顛茄TAs前體物腐胺的影響機(jī)制, 本研究檢測(cè)了處理16 d時(shí)顛茄葉片ODC和ADC酶活性。由圖2可知, UV-B脅迫處理顯著降低了ODC與ADC酶活性, 分別為CK1組的34.53%、33.32%。添加外源MeJA處理后, 2種酶活性均有一定程度的提高, 且ODC和ADC 2種酶在同一處理下有相似的活性, 在T3處理組下2種酶活性最高, 分別較CK2組顯著提高了43.97%、36.77%。T2處理組下ADC酶活性也維持在較高水平, 且與T3處理組之間無(wú)顯著性差異, 與CK2組相比顯著提高了28.67%。說明適宜濃度的MeJA處理可提高UV-B脅迫下顛茄葉片中ODC和ADC酶活性, 其活性的增強(qiáng)有助于顛茄催化合成更多腐胺, 為TAs的生物合成提供充足的前體物質(zhì)。

圖1 不同濃度外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片鳥氨酸和精氨酸含量的影響

標(biāo)以不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(< 0.05)。處理同表2。

Bars superscripted by different lowercase letters show significant differences among different treatment groups at< 0.05. Treatments are the same as those given in Table 2.

圖2 不同濃度外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片ODC和ADC酶活性的影響

標(biāo)以不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(< 0.05)。處理同表2。

Bars superscripted by different lowercase letters show significant differences among different treatment groups at< 0.05. Treatments are the same as those given in Table 2.

2.4 外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片多胺合成的影響

多胺(PAs)是一類具有2個(gè)或多個(gè)氨基的低分子量有機(jī)化合物, 在植物體內(nèi)主要有腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm) 3種類型, 大多數(shù)以游離態(tài)的形式存在, 且三者之間可進(jìn)行可逆性的多胺代謝[23], 其中Put是直接進(jìn)入到顛茄TAs合成的前體物質(zhì)。圖3為檢測(cè)處理16 d時(shí)顛茄葉片中Put、Spd和Spm的含量。UV-B脅迫下, CK2組的Put和Spd含量較CK1組顯著降低, 而Spm含量較CK1組無(wú)顯著性差異。添加不同濃度MeJA處理后, Put含量與Spd含量的變化一致, Put含量較高時(shí), Spd含量也相應(yīng)地較高, 并且二者含量均隨MeJA濃度的升高先升高后降低, 以T2處理下二者含量最高, 分別為CK2組的1.55倍、2.81倍。Spm含量的變化趨勢(shì)與Put、Spd含量變化不一致, 與CK2組相比, Spm含量在T3處理組下最高, 在其他處理組(T1、T2、T4)下均無(wú)顯著性變化?？傮w而言, 外源MeJA處理后, 三者含量在T1組和T4組中均無(wú)顯著變化, Put和Spd含量在T2組中均達(dá)到最大, T3組的Spm含量最高, 同時(shí)Put和Spd含量也維持在較高的水平(圖3-A)。UV-B脅迫下多胺總量顯著降低, 僅為CK1的58.48%, 添加不同濃度的外源MeJA后, 多胺總量均有一定程度的提高, 其中以T2處理組的提高幅度最大, T3處理組次之, 但兩組之間多胺總量無(wú)顯著性差異, 分別為CK2的1.66倍和1.47倍(圖3-B)。Put向Spd和Spm轉(zhuǎn)化有利于提高植物的抗逆能力, 因此, (Spm+Spd)/Put比值可作為檢測(cè)植物耐逆性的一個(gè)參考指標(biāo)[24]。T3組的(Spm+Spd)/Put比值顯著升高, 其他處理組均無(wú)明顯差異, 說明長(zhǎng)期UV-B脅迫下, 250 μmol L-1的MeJA處理可顯著提高 (Spm+Spd)/Put比值(圖3-C)。

以上結(jié)果表明, 長(zhǎng)期UV-B脅迫下, 顛茄葉片中多胺的積累被顯著抑制, 適宜濃度的MeJA可有效緩解UV-B脅迫對(duì)多胺含量的抑制作用, 增強(qiáng)UV-B脅迫下顛茄的抗逆性, 同時(shí)為TAs的合成提供充足的物質(zhì)供應(yīng)。

2.5 外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下信號(hào)分子NO濃度的影響

一氧化氮(NO)是一種重要的信號(hào)分子, 能夠直接作用于細(xì)胞靶蛋白和基因, 從而調(diào)控植物體內(nèi)各種生理過程, 包括次生代謝產(chǎn)物的合成[25]。為明確茉莉酸甲酯是否通過信號(hào)分子NO調(diào)控UV-B脅迫下顛茄葉片TAs的合成, 本試驗(yàn)測(cè)定了處理16 d時(shí)顛茄葉片中NO的濃度, 從信號(hào)分子途徑探索MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄TAs合成的調(diào)控機(jī)制。由圖4可知, UV-B脅迫顯著降低了顛茄葉片中NO的濃度, CK2組的NO濃度相比CK1組降低了39.3%。外源MeJA處理后, 各處理組的NO濃度較CK2組均有一定程度的升高, 其中T3處理組的NO濃度升高幅度最大, 為CK2組的1.57倍, 除T3處理組有較大幅度的升高之外, 其他處理組對(duì)NO升高的作用不明顯, 各處理組間無(wú)顯著性差異。表明適宜濃度的外源MeJA處理能緩解UV-B脅迫造成的顛茄葉片NO濃度的降低, 刺激NO的迸發(fā), 其中MeJA濃度為250 μmol L-1時(shí)效果最顯著。

圖3 不同濃度外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片多胺含量(A),多胺總量(B)和(Spm+Spd)/Put比值(C)的影響

標(biāo)以不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(< 0.05)。處理同表2。

Bars superscripted by different lowercase letters show significant differences among different treatment groups at< 0.05. Treatments are the same as those given in Table 2.

圖4 不同濃度外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片NO濃度的影響

標(biāo)以不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(< 0.05)。處理同表2。

Bars superscripted by different lowercase letters show significant differences among different treatment groups at< 0.05. Treatments are the same as those given in Table 2.

2.6 外源茉莉酸甲酯對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片TAs生物合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

N-甲基-腐胺轉(zhuǎn)移酶(putrescine n-methyltransferase, PMT)、托品酮還原酶 I (tropinone reductase I, TR I)、苯丙酮酸還原酶(phenylpyruvate reductase, PPAR)和莨菪堿-6-β-羥化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase, H6H)是目前從茄科植物中已鑒定的TAs合成途徑中的4個(gè)關(guān)鍵酶, 其相應(yīng)編碼基因的表達(dá)量直接決定合成途徑的中間產(chǎn)物流向以及生物堿的產(chǎn)量[26]。以為內(nèi)參基因, 采用qRT-PCR分別檢測(cè)了外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下處理16 d時(shí)顛茄葉片和根部和和基因相對(duì)表達(dá)量。由于具有組織表達(dá)特異性[27],在須根的中柱鞘和內(nèi)皮層特異表達(dá)[22], 因此顛茄中和基因在根中特異性表達(dá), 在葉片中幾乎不表達(dá)。本試驗(yàn)也未在葉片中檢測(cè)到這3種基因的表達(dá)。

UV-B脅迫16 d時(shí), CK2組中的相對(duì)表達(dá)量較CK1組有所升高, 但沒有差異性。在外源MeJA處理后, 除T4處理組有輕微提高外, 其他處理組中的相對(duì)表達(dá)量較CK2組均顯著性升高(圖5-A)。相較于葉片, 根部的表達(dá)量在UV-B脅迫下較CK1組同樣有所增加, 但不顯著。在外源MeJA處理后,的表達(dá)水平隨MeJA濃度的增加先升高后降低, 以T3處理組最高。對(duì)于和這3個(gè)基因, CK2組和CK1組對(duì)比發(fā)現(xiàn), UV-B脅迫下,的表達(dá)量均顯著降低,的表達(dá)量有輕微下降。用外源MeJA處理后,的表達(dá)量均有一定程度的提高, 其中在250 μmol L-1處理下這2個(gè)基因具有最高表達(dá)水平。而添加外源MeJA之后, 對(duì)的表達(dá)量變化影響不顯著(圖5-B)。表明UV-B脅迫顯著抑制了顛茄根中基因的表達(dá)水平, 而外源添加MeJA處理后, 顛茄葉片和根部和基因都有較高的表達(dá)水平, 其中以250 μmol L-1時(shí)效果最好, 可以有效緩解UV-B脅迫對(duì)表達(dá)的抑制作用, 這也符合該處理下莨菪堿和東莨菪堿含量都較高的情況。

圖5 不同濃度外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄葉片(A)、根(B)中PMT、TR I、PPAR、H6H基因表達(dá)量的影響

標(biāo)以不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(< 0.05)。處理同表2。

Bars superscripted by different lowercase letters show significant differences among different treatment groups at< 0.05. Treatments are the same as those given in Table 2.

3 討論

增強(qiáng)UV-B輻射能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)紫外吸收物含量的增加[28]。在本試驗(yàn)中, 短期UV-B脅迫刺激顛茄葉片莨菪堿的積累, 但中長(zhǎng)期的UV-B脅迫則顯著降低莨菪堿和東莨菪堿的含量, 這與盧克歡等[4]的研究結(jié)果相似。推測(cè)顛茄中的莨菪堿和東莨菪堿不是吸收紫外的物質(zhì), UV-B脅迫不利于顛茄TAs的合成。MeJA作為外源誘導(dǎo)子對(duì)植物次生代謝途徑及其代謝產(chǎn)物的合成具有重要調(diào)控作用。段永波等[29]研究發(fā)現(xiàn), 外源誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯處理能顯著提高半夏懸浮細(xì)胞中生物堿含量和生物堿合成相關(guān)酶的活性。張翠平[30]研究發(fā)現(xiàn), 適宜濃度的茉莉酸甲酯能提高顛茄托品烷類生物堿含量和TAs合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá), 促進(jìn)其次生代謝途徑。本試驗(yàn)也得到類似的結(jié)果, 外源施加適宜濃度MeJA處理后, 顛茄莨菪堿和東莨菪堿含量均有顯著提高, 表明外源MeJA可有效緩解UV-B脅迫對(duì)顛茄TAs積累的抑制, 推測(cè)外源MeJA通過調(diào)控UV-B脅迫下顛茄體內(nèi)TAs代謝途徑來提高TAs的合成。

腐胺是TAs合成的前體物質(zhì), 植物體內(nèi)主要通過2種途徑合成腐胺: (1)鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶的催化作用下直接催化脫羧形成腐胺; (2)精氨酸在精氨酸脫羧酶的催化作用下生成精胺, 然后經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成腐胺[31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, UV-B脅迫下, 鳥氨酸和精氨酸含量較CK1組均顯著降低, 外施250 μmol L-1MeJA后, 二者含量均有顯著提高, 從而為腐胺的合成提供更多底物, 且較鳥氨酸, 對(duì)提高精氨酸含量的作用更大, 推測(cè)精氨酸在顛茄腐胺合成中占主導(dǎo)地位, 這與郭雙[32]提出的精氨酸含量與顛茄TAs的產(chǎn)量有顯著正相關(guān)關(guān)系的結(jié)論一致。非生物脅迫可能抑制顛茄基因的表達(dá), 而促進(jìn)基因表達(dá), 進(jìn)而使腐胺含量增加[33]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn), 腐胺合成關(guān)鍵酶ODC和ADC活性在UV-B脅迫下均顯著降低, 說明UV-B脅迫抑制了這2種關(guān)鍵酶的活性, 不利于腐胺含量的積累。而外源噴施MeJA后, 其活性均有一定程度的提高。ADC活性水平同樣高于ODC活性, 植物體內(nèi)Put的合成主要依賴于ADC途徑[34], 結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè), MeJA主要通過促進(jìn)ADC途徑來提高UV-B脅迫下腐胺的合成, 為TAs合成提供更多的底物。

腐胺合成后可沿2個(gè)方向轉(zhuǎn)化, 一是可逆形成亞精胺, 亞精胺又可逆形成精胺; 二是經(jīng)PMT催化形成N-甲基-腐胺, 進(jìn)入到合成TAs的方向。UV-B輻射下分解多胺的多胺氧化酶活性增加[35], 本試驗(yàn)結(jié)果顯示, UV-B脅迫顯著降低了多胺含量, 推測(cè)UV-B脅迫導(dǎo)致顛茄多胺降低可能是由于UV-B誘導(dǎo)的酶促降解或合成減少。外源MeJA處理后, 可有效緩解UV-B脅迫對(duì)顛茄葉片中多胺積累的抑制作用, 150 μmol L-1MeJA處理下, 顛茄體內(nèi)的Put含量最高, 而250 μmol L-1MeJA處理下, Spm含量最高, 同時(shí)Spd、Put也都保持在較高的水平, 結(jié)合前面各處理組腐胺合成關(guān)鍵酶活性的情況來看, T3處理組下ODC、ADC活性最高, 推測(cè)T3組腐胺含量低于T2組可能是由于該處理下TAs含量較高, 生成的腐胺迅速進(jìn)入次生代謝用于TAs的合成, 因此腐胺的積累較少, 表明適宜濃度的MeJA可促進(jìn)腐胺更多的向合成TAs的方向進(jìn)行。Spd和Spm在植物應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)具有更為有效地保護(hù)作用, (Spm+Spd)/Put比值升高是植物提高耐逆性的一個(gè)重要機(jī)制[23], 本試驗(yàn)中, T3處理組的(Spm+Spd)/Put比值顯著性升高, 其他處理組均無(wú)顯著性變化。說明250 μmol L-1MeJA能增強(qiáng)UV-B脅迫下顛茄的耐逆性, 抵御UV-B脅迫, 同時(shí)促進(jìn)更多的前體物腐胺流向TAs合成。

NO是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子, 在植物體內(nèi)廣泛存在。其在逆境脅迫誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的過程中扮演著重要角色。在植物體內(nèi), NO的來源除了有一氧化氮合酶(NOS)途徑外, 硝酸還原酶(NR/NiR)也是主要的途徑之一。NR可以在NADPH提供電子的情況下, 催化NO2–生成NO[36], 本研究發(fā)現(xiàn), UV-B脅迫顯著抑制了顛茄葉片中NO的濃度。盧克歡等[37]研究發(fā)現(xiàn), UV-B脅迫能夠顯著降低顛茄NR活性, 因此猜測(cè)可能是NR活性影響了細(xì)胞內(nèi)NO濃度, UV-B脅迫導(dǎo)致NR活性顯著降低, 使得顛茄葉片NO濃度也降低。外源MeJA處理后, NO濃度有一定的提高, 且以MeJA濃度為250 μmol L-1處理下最高。對(duì)應(yīng)TAs含量的情況發(fā)現(xiàn), 該濃度處理下顛茄TAs含量也達(dá)到最高, 說明UV-B脅迫下, 外源MeJA處理刺激了顛茄葉片中NO的迸發(fā), 猜測(cè)增加的NO有利于顛茄TAs含量的提升。黑曲霉細(xì)胞壁誘導(dǎo)子可以同時(shí)誘發(fā)金絲桃細(xì)胞的NO迸發(fā)、JA合成和金絲桃素的積累, 并且誘導(dǎo)子對(duì)JA合成的促進(jìn)作用可以被NO專一性淬滅劑阻斷, 而NO對(duì)金絲桃素的促進(jìn)作用也可以被JA合成抑制劑IBU和NDGA阻斷, NO作用于JA的上游并對(duì)JA 信號(hào)途徑起調(diào)控作用[38-39]。Put和NO有共同的合成前體, 在影響植物次生代謝產(chǎn)物合成的過程中存在著交互作用, NO可以刺激細(xì)胞中多胺的合成[40]。結(jié)合多胺含量的情況, T3處理組下Put含量也達(dá)到較高的水平。因此猜測(cè)NO信號(hào)分子可能參與顛茄葉片中TAs的合成, NO含量的增加刺激多胺的快速合成, 使更多的Put快速進(jìn)入TAs合成途徑中。NO可能作用于MeJA信號(hào)途徑的上游, 參與UV-B脅迫下MeJA對(duì)顛茄TAs合成的調(diào)控, 但關(guān)于兩者在調(diào)控逆境下顛茄次生代謝方面具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)中, UV-B脅迫顯著抑制了、在根部的表達(dá)量,的表達(dá)量?jī)H輕微下降, 添加外源MeJA后, 各處理組和在根部的表達(dá)量都隨MeJA濃度的升高而先升高后降低, 其中在MeJA濃度為250 μmol L-1下和基因表達(dá)量均達(dá)到最高。同時(shí), 這2個(gè)基因的表達(dá)量與該濃度處理時(shí)間條件下莨菪堿和東莨菪堿含量的變化基本一致, 說明促進(jìn)苯丙酮酸還原酶催化苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為苯乳酸, 苯乳酸進(jìn)入TAs生物合成途徑中參與莨菪堿的合成[22];表達(dá)量升高, 促進(jìn)莨菪堿生成東莨菪堿。的表達(dá)量雖有上升, 但各處理組之間無(wú)顯著性差異, 表明UV-B脅迫下MeJA處理對(duì)顛茄中在根部的表達(dá)量影響不大。對(duì)于來說, 它在顛茄葉片和根部都能表達(dá), 且表達(dá)情況基本相同。在UV-B脅迫下,在葉片和根部的表達(dá)量均有一定程度的提高, 但不顯著, 外源MeJA處理后, 各處理組中的表達(dá)量有更進(jìn)一步的提高, 盧克歡等[37]的研究也發(fā)現(xiàn), UV-B脅迫下顛茄在葉片和根部的表達(dá)量都有輕微地提高, 而外源Ca2+處理下有更高表達(dá), 本試驗(yàn)與其研究結(jié)果相似, 推測(cè)可能是UV-B脅迫誘導(dǎo)TAs代謝途徑中的上游某一產(chǎn)物或某些產(chǎn)物的增加或積累, 導(dǎo)致表達(dá)量增加; 也可能是下游的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)抵御紫外有作用, 是吸收紫外的物質(zhì), 所以促進(jìn)下游產(chǎn)物的合成; MeJA處理使有更高的表達(dá)量,表達(dá)量的增加能夠促進(jìn)代謝更多的向莨菪堿和東莨菪堿方向進(jìn)行。表明外源MeJA處理有助于緩解UV-B脅迫對(duì)、表達(dá)的抑制作用, 提高的表達(dá)量, 因此推測(cè)MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄的TAs含量的提升主要依靠、和基因表達(dá)量的提高。

4 結(jié)論

UV-B脅迫顯著抑制了顛茄TAs的積累, 影響莨菪堿向東莨菪堿的轉(zhuǎn)化, 適宜濃度的MeJA處理有助于緩解UV-B脅迫對(duì)顛茄TAs的抑制作用, 提高TAs的含量, 促進(jìn)莨菪堿向東莨菪堿的轉(zhuǎn)化, 且MeJA濃度為250 μmol L–1時(shí)效果最佳。而外源MeJA對(duì)UV-B脅迫下顛茄TAs代謝的調(diào)控, 則主要是通過提高TAs合成途徑的前體物質(zhì)和刺激關(guān)鍵酶基因、和的高效表達(dá)起作用。

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Mechanism exploration on alkaloids accumulation and TAs metabolic pathways regulation inL. treated with exogenous methyl jasmonate under UV-B stress

SHAN Yu-Si1,2, XIN Zheng-Qi1,2, HE Xiao1,2, DAI Huan-Huan1,2, and WU Neng-Biao1,2,*

1School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Region, Ministry of Education, Chongqing 400715, China

In order to preliminarily explore the mechanism of TAs metabolic pathway intreated with exogenous methyl jasmone under UV-B stress, the effects on the contents of hyoscyamine and scopolamine, the upstream products in alkaloid synthesis, signal molecule and the expression level of key enzyme genes of secondary metabolism were studied under different concentrations of exogenous MeJA and different treatment time under usingas materials. UV-B stress treatment significantly reduced the contents of hyoscyamine and scopolamine, inhibited the accumulation of precursors in the TAs synthesis pathway, which harmful to TAs synthesis. The content of TAs inincreased to some extent, the contents of precursor amino acids (ornithine, arginine), polyamine content and key enzymes activities in the synthesis of putrescine in the secondary metabolic pathway all increased to some extent after treatment with the appropriate concentration of MeJA. The concentrations of signal molecule NO firstly increased and then decreased with the rising MeJA concentration, and reached the highest when MeJA concentration was 250 μmol L–1. The expression of key enzyme genes in TAs synthesis pathway showed that exogenous MeJA could increase the relative gene expression levels of,,to some extent. Those indicated that exogenous MeJA could induce the increase in the contents of upstream products in TAs synthesis by stimulating the burst of NO resulted in more precursor materials for the TAs synthesis pathway and affect the high expression of,and. It alleviated the inhibiton of UV-B stress on TAs ofand increased the contents of hyoscyamine and scopolamine effectively. The results provided a theoretical basis for further studying the mechanism of exogenous elicitors to regulate the TAs secondary metabolic pathway ofunder stress, and effectively improved the stress resistance ofand the accumulation of medicinal ingredients in actual production.

methyl jasmonate; UV-B stress;L.; tropane alkaloids; secondary metabolism

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500041)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30500041).

吳能表, E-mail: wunb@swu.edu.cn, Tel: 023-68252147

E-mail: shanyusi3354@foxmail.com

2020-02-28;

2020-06-02;

2020-07-28.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200728.1502.002.html

10.3724/SP.J.1006.2020.04050