宋欣冉 胡書婷 張 凱 崔則瑾 李建生 楊小紅 白光紅*

玉米籽粒突變體的表型分析和精細(xì)定位

宋欣冉1,**胡書婷2,**張 凱2崔則瑾2李建生2楊小紅2白光紅1,*

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 新疆烏魯木齊 830052;2中國農(nóng)業(yè)大學(xué) / 國家玉米改良中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部玉米生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193

籽粒作為玉米儲藏器官, 其發(fā)育程度和物質(zhì)儲存直接影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究在玉米雙單倍體系選育過程中發(fā)現(xiàn)可穩(wěn)定遺傳的籽粒缺陷突變體, 命名為()。該突變體籽粒皺縮, 粒重顯著降低, 胚致死, 胚乳發(fā)育缺陷, 不能成苗。在授粉后12 d,開始出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常, 授粉后21 d籽粒鮮重、干重、體積不再增加。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 與野生型相比,淀粉粒顯著變小。遺傳分析證實(shí)該突變性狀受隱性單基因控制。利用441個(gè)F2單株和1648個(gè)F3單株, 將該基因定位在1號染色體的標(biāo)記IDP2182和IDP4600之間, 物理區(qū)間約300 kb, 共有5個(gè)預(yù)測基因。這些結(jié)果為挖掘與玉米籽粒發(fā)育有關(guān)的功能基因, 解析籽粒發(fā)育機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

玉米; 籽粒缺陷突變體; 精細(xì)定位

胚乳作為玉米籽粒儲藏物質(zhì)的重要器官, 占籽粒干物質(zhì)的70%~90%[1]。在玉米生殖生長發(fā)育過程中, 胚乳作為主要的庫器官積累淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)直至生理成熟。同時(shí), 在玉米種子萌發(fā)過程中為胚的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。所以, 深入挖掘玉米籽粒形成和發(fā)育的關(guān)鍵基因, 解析籽粒發(fā)育規(guī)律和遺傳調(diào)控機(jī)制, 對提高玉米產(chǎn)量和改良玉米品質(zhì)具有重要意義。

籽粒突變體是作物種子發(fā)育基因克隆的重要遺傳材料。目前為止, 以籽粒突變體為材料已經(jīng)克隆了大量控制玉米籽粒發(fā)育的基因, 如參與碳水化合物代謝相關(guān)基因、等, 這些基因的功能喪失降低了胚乳淀粉含量[2-6], 并在甜玉米、糯玉米等特用玉米品種選育中得到廣泛的應(yīng)用; 影響胚發(fā)育, 如、等基因突變通過擾亂線粒體RNA編輯、葉綠體中核糖體亞基組裝、減數(shù)分裂中核內(nèi)復(fù)制等過程導(dǎo)致胚敗育[7-13]。除了影響胚發(fā)育和胚乳淀粉累積的基因突變體外, 影響玉米籽粒蛋白品質(zhì)的基因, 如、、等突變改善了籽粒中賴氨酸等必需氨基酸比例, 使玉米蛋白品質(zhì)大幅提高, 但同時(shí)也帶來了許多不良性狀, 如產(chǎn)量降低、籽粒變軟、抗病性下降等, 難以達(dá)到育種推廣的基本要求[14-17]。最近, 黃永財(cái)?shù)萚18]發(fā)現(xiàn)在籽粒發(fā)育早期特異性的高表達(dá), 證明早期的胚乳細(xì)胞數(shù)目決定最終籽粒大小, 為玉米產(chǎn)量的遺傳改良提供了候選基因。鄭喜喜等[19]發(fā)現(xiàn)直接調(diào)控玉米胚盾片的發(fā)育, 并參與控制胚乳和胚間營養(yǎng)重分配的過程。綜上, 對玉米籽粒發(fā)育有關(guān)突變體的遺傳研究, 對選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)玉米新品種具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究以玉米DH系選育過程中發(fā)現(xiàn)的玉米籽粒突變體為研究材料, 通過對籽粒發(fā)育動態(tài)的觀察、籽粒表型的測定和遺傳分析與精細(xì)定位, 為玉米籽粒發(fā)育基因的克隆及籽粒發(fā)育機(jī)制的解析奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及田間試驗(yàn)

本研究所用的籽粒突變體來源于美國玉米帶種質(zhì)的雙單倍體選系(double haploid, DH), 即以PH4CV/PHB1M//PH4CV為材料, 用誘導(dǎo)系CM500誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體加倍材料。由于播種不能萌發(fā), 故用雜合植株()與自交系B73雜交得到F1, 自交后, 獲得F2和F3群體, 用于該突變基因的精細(xì)定位。種植方式為行長5 m, 每行21株, 行距0.5 m, 株距0.25 m, 按照當(dāng)?shù)氐脑耘喾椒ü芾怼?/p>

1.2 突變體的籽粒表型觀察

2015年在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京上莊試驗(yàn)站種植雜合植株(), 播種自交后, 分別取授粉后6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和36 d的野生型和突變型籽粒各80粒, 觀察授粉后不同發(fā)育時(shí)期表型變化。

1.2.1 籽粒發(fā)育動態(tài)觀察 挑取授粉后不同天數(shù)具代表性的野生型和突變型籽粒各1粒，照相記錄, 觀察籽粒發(fā)育動態(tài)過程。

1.2.2 籽粒鮮重和干重 挑選具有代表性的純合野生型和雜合果穗()各3個(gè), 取每個(gè)果穗中部具有代表性的野生型和突變型籽粒各50粒, 使用分析天平稱量, 記錄籽粒鮮重后, 保存于?20℃冰箱, 待全部取樣結(jié)束后, 將各個(gè)時(shí)期的籽粒取出并于65℃條件下烘72 h, 記錄烘干后的干重。

1.2.3 籽粒體積測量 采用排酒精法進(jìn)行測量, 取野生型和突變型籽粒各20粒, 倒入滴定管, 讀取加入籽粒前后液面刻度變化的差值, 即為20粒籽粒體積。

1.2.4 胚乳掃描電鏡觀察 分別取15、21和27 DAP (days after pollination)具有代表性的正常和突變型籽粒各6粒, 縱切后保存在FAA固定液中并抽真空, 通過緩沖液沖洗、乙醇梯度脫水、噴金等過程, 利用日立S-3400N掃描電鏡進(jìn)行胚乳淀粉粒觀察。

1.3 突變體的遺傳分析

對雜合植株(+/)與B73雜交自交一代得到的4個(gè)結(jié)實(shí)較好的F2籽粒分離果穗進(jìn)行表型鑒定, 計(jì)算每個(gè)果穗以及所有果穗中野生型籽粒和突變型籽粒的數(shù)目, 利用卡方測驗(yàn)進(jìn)行3∶1分離比檢驗(yàn)。

1.4 DNA提取和精細(xì)定位

種植F2定位群體, 采用CTAB法提取玉米葉片基因組DNA和44個(gè)突變籽粒的基因組DNA。從Maize GDB (https://www.maizegdb.org/)數(shù)據(jù)庫, 下載均勻覆蓋在玉米基因組10條染色體的271對InDel標(biāo)記, 篩選103個(gè)在突變體和自交系B73間具有多態(tài)性的標(biāo)記。根據(jù)/B73的F2分離群體中每個(gè)單株授粉后果穗的表型, 挑選野生型、雜合類型DNA個(gè)體以及15 DAP的雜合果穗上表現(xiàn)缺陷型籽粒胚乳DNA各44個(gè), 每11個(gè)個(gè)體混為1個(gè)樣品池。用篩選到的多態(tài)性引物擴(kuò)增2個(gè)親本和12個(gè)樣品池, 使用瓊脂糖凝膠電泳, 具有“”的帶型記為1, 具有“B73”的帶型記為2, 雜合的單株記為3。

利用組配的F2定位群體的441株個(gè)體及篩選得到的5個(gè)InDel標(biāo)記, 將目的區(qū)段初步定位于標(biāo)記IDP7291與IDP78之間。為驗(yàn)證該結(jié)果并進(jìn)一步縮小定位區(qū)間, 對目的區(qū)間附近沒有公共標(biāo)記的區(qū)域, 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Primer-BLAST (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)工具, 在有功能注釋基因的5′-UTR、3′-UTR及跨內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)引物, 根據(jù)一代測序結(jié)果, 進(jìn)一步開發(fā)InDel標(biāo)記(表1)。再利用F2群體篩選到的重組類型播種所得1648株F3代個(gè)體, 以進(jìn)一步縮小目的區(qū)間。

表1 在親本間有多態(tài)性InDel引物

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒突變體dek101的籽粒特征

觀察突變體籽粒發(fā)現(xiàn), 與野生型相比, 突變型籽粒嚴(yán)重干癟, 粒重顯著降低, 胚致死, 胚乳發(fā)育嚴(yán)重缺陷, 籽粒顏色灰白(圖1-A, B)。對籽粒發(fā)育動態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn), 在9 DAP時(shí), 突變型籽粒與野生型籽粒相比發(fā)育狀態(tài)基本一致; 12 DAP時(shí), 野生型籽粒呈淡黃色, 突變型籽粒呈乳白色, 胚發(fā)育異常(圖1-C), 表明該突變在籽粒發(fā)育早期階段就能影響籽粒的發(fā)育。隨著籽粒發(fā)育, 鮮重、干重和體積逐漸增大, 在21 DAP時(shí)達(dá)到最大, 之后突變體籽粒鮮重和體積逐漸減小, 干重不再增加, 表明突變籽粒無法進(jìn)行正常的物質(zhì)積累, 最終表現(xiàn)為胚敗育的干癟籽粒(圖1-D~F)。

圖1 籽粒發(fā)育動態(tài)及授粉后不同時(shí)期野生型籽粒和突變型籽粒對比

A: 雜合果穗; B: 30 DAP時(shí)突變型籽粒和野生型籽粒對比; C: 授粉后不同時(shí)期野生型與突變型籽粒發(fā)育動態(tài); D~E: 50顆野生型和突變型籽粒不同時(shí)期干重、鮮重的變化; F: 20顆野生型和突變型籽粒不同時(shí)期體積的變化。WT: 野生型籽粒;: 突變體籽粒。A~C圖標(biāo)尺為1 cm。**, 突變型籽粒與野生型相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異(< 0.01)。DAP: 授粉后天數(shù)。

A: Ear performance of heterozygous plants; B: Comparison ofand wild-type kernels at 30 days after pollination; C: Developmental dynamics of wild-type and mutant kernels in different time series; D–E: Dynamics changes in dry weight, fresh weight of 50 wild-type andkernels at different stages. F: Dynamics changes in volume of 20 wild-type andkernels at different stages. WT: wild type;: mutant. Bar in A–C: 1 cm.**, indicates extremely significant difference of expression in specific tissues betweenand WT (< 0.01). DAP: days after pollination.

2.2 不同發(fā)育時(shí)期dek101胚乳細(xì)胞的掃描電鏡觀察

為了進(jìn)一步觀察突變型籽粒粒重降低原因, 我們使用掃描電鏡分別觀察15、21和27 DAP胚乳細(xì)胞中淀粉粒形態(tài)的變化。在相同時(shí)期, 野生型胚乳細(xì)胞中淀粉粒形態(tài)均勻, 排列有序; 突變體淀粉粒體積顯著變小且排列疏松, 局部有明顯空腔, 基質(zhì)蛋白增多, 且有更多填充異常的小淀粉粒。隨著授粉天數(shù)的增加, 野生型和突變體的淀粉粒不斷增大, 發(fā)育過程中不斷進(jìn)行淀粉的積累, 且野生型淀粉粒物質(zhì)填充更為飽滿, 排列更為緊密, 證實(shí)了突變體在發(fā)育過程中籽粒重量的變化趨勢(圖2-A，B, D，E)。突變體籽粒的淀粉粒在發(fā)育過程中也有所增大, 但與野生型籽粒相比增長速率較為緩慢, 并在27 DAP籽粒胚乳細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)較多小淀粉粒, 可能與突變基因參與調(diào)控胚乳細(xì)胞中淀粉粒的退化有關(guān)(圖2-C, F)。

2.3 dek101由隱性單基因控制

對4個(gè)F2分離果穗中的野生型和突變型籽粒粒數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 并對兩者的分離比進(jìn)行卡方測驗(yàn), 結(jié)果表明野生型籽粒與突變型籽粒的分離比例符合3∶1的孟德爾分離定律理論比例(表2), 表明該突變性狀受隱性單基因控制。

圖2 野生型與dek101籽粒淀粉粒掃描電鏡觀察

A~C: 授粉后15、21和27 d野生型籽粒掃描電鏡觀察; D~F: 授粉后15、21和27 d突變型籽粒掃描電鏡觀察。A~F圖標(biāo)尺: 5 μm。

A–C: SEM observation of wild-type kernel of 15, 21, and 27 DAP; D–F: SEM observation of mutant type kernel of 15, 21, and 27 DAP. Bar = 5 μm.

表2 F2果穗突變型籽粒的分離比例

χ20.05,1=3.84

2.4 dek101被精細(xì)定位到300 kb區(qū)間

為了克隆基因, 我們利用自交系B73和雜合植株()組配的F2群體進(jìn)行初步定位。根據(jù)Maize GDB公共標(biāo)記數(shù)據(jù)庫, 選擇均勻覆蓋玉米10條染色體的271對InDel標(biāo)記, 共篩選到103個(gè)在突變體和自交系B73間具有多態(tài)性的標(biāo)記。采用集團(tuán)分離分析法(bulked segregation analysis, BSA), 對F2群體中野生型、雜合型和突變型胚乳DNA的混池進(jìn)行多態(tài)性篩選, 發(fā)現(xiàn)1號染色體上2個(gè)分子標(biāo)記IDP7291和IDP78可能與目標(biāo)性狀連鎖。

隨后, 在IDP7291和IDP78之間加密3個(gè)InDel標(biāo)記(IDP8216、IDP8266和IDP101), 利用F2群體的441個(gè)個(gè)體將初步定位在1號染色體短臂標(biāo)記IDP101與IDP78之間, 物理區(qū)間為3.1 Mb。為進(jìn)一步精細(xì)定位, 將檢測到的重組單株于2019年夏季在內(nèi)蒙播種, 獲得1648個(gè)F3單株, 在IDP101與IDP78之間繼續(xù)加密標(biāo)記(IDP643、IDP2182和IDP4600) (表1), 篩選重組單株, 結(jié)合表型將精細(xì)定位在標(biāo)記IDP2182和IDP4600之間, 物理距離約為300 kb (圖3)。

: F2群體大小以及F3群體數(shù)目; 黑色豎線代表引物位置; 標(biāo)記下方的紅色數(shù)字代表重組單株數(shù)目; 矩形框代表5個(gè)重組類型的基因型以及對應(yīng)的籽粒表型, 黑色矩形代表B73基因型, 灰色矩形代表雜合基因型。

: individuals of F2and recombinant-derivedF3population; the black vertical lines represent primary physical distance; the red numbers under InDel markers represent recombination events; the rectangular boxes represent the genotypes and phenotypes of five recombinants; the black and gray rectangles represent B73 and heterozygous genotypes, respectively.

利用Gramene網(wǎng)站檢索, 在該區(qū)間內(nèi)共有5個(gè)注釋基因, 包括1個(gè)WD40家族蛋白、3個(gè)病程相關(guān)蛋白基因和1個(gè)鈣蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶(表3)。為了預(yù)測候選基因, 利用Chen等[20]發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究目標(biāo)區(qū)段5個(gè)基因的組織表達(dá)特性, 發(fā)現(xiàn)3個(gè)病程相關(guān)蛋白基因在籽粒發(fā)育早期表達(dá)量都較低, 在發(fā)育晚期表達(dá)較高; WD家族蛋白和鈣蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶基因在玉米各個(gè)組織都有表達(dá), 且在籽粒發(fā)育早期具有較高的表達(dá)量(圖4)。這些結(jié)果表明Zm00001d028813和Zm00001d028818很有可能是的候選基因。

3 討論

籽粒作為玉米光合產(chǎn)物的重要貯藏器官, 由胚、胚乳和種皮3個(gè)部分構(gòu)成, 其中胚乳在玉米籽粒發(fā)育過程中積累淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì); 胚作為新生植株的幼體, 其萌發(fā)所需的營養(yǎng)物質(zhì)來自于胚乳。因此, 以籽粒突變體為遺傳材料, 挖掘調(diào)控其發(fā)育的相關(guān)基因, 并揭示籽粒發(fā)育的分子機(jī)制, 對玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的遺傳改良具有重要意義。

圖4 區(qū)段內(nèi)5個(gè)預(yù)測基因在玉米自交系B73中不同組織的表達(dá)量

SAM: shoot apical meristem.

表3 dek101定位區(qū)間的候選基因注釋

籽粒缺陷突變體在12 DAP, 胚發(fā)育明顯異常, 籽粒顏色發(fā)白; 完熟期的突變型籽粒, 胚敗育, 胚乳發(fā)育異常, 籽粒嚴(yán)重皺縮。在目前已報(bào)道的籽粒突變體中, 如、、、、、[2-3,6,21-23]籽粒胚發(fā)育正常, 胚乳呈現(xiàn)不同程度的皺縮或變小;、、[12-13,24]等突變籽粒胚敗育, 但幾乎不影響胚乳發(fā)育;、、、、、、[25-31]有可以萌發(fā)的突變籽粒, 苗期致死;、、、、[9-11,32-33]種子完全不能萌發(fā), 為胚致死突變。通過表型比較,突變籽粒則與、、、、等類似, 胚致死, 突變籽粒完全不能萌發(fā)。除這些表型之外, 本研究還系統(tǒng)地觀察了突變體和野生型籽粒鮮重和干重的動態(tài)變化, 均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(圖1-D~E), 這與籽粒不同發(fā)育時(shí)期的含水量以及干物質(zhì)積累有關(guān)。

在已報(bào)道的籽粒突變體中,、、、、等[9-11,32-33]相關(guān)基因已被克隆。編碼黏連蛋白亞基SCC4 (sister chromatid cohesion protein 4), 該基因突變后使細(xì)胞周期和核內(nèi)復(fù)制受到擾亂, 導(dǎo)致種子完全不能萌發(fā)[9];基因編碼TTI2 (Tel2-interaction protein 2)分子伴侶蛋白, 影響雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育[10];編碼三角狀五肽重復(fù)蛋白, 該基因突變后導(dǎo)致線粒體復(fù)合體I亞基NAD4的第3個(gè)內(nèi)含子剪切效率降低, 從而導(dǎo)致了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶活性下降[33]; DEK44蛋白功能的喪失影響了線粒體和細(xì)胞核基因組中呼吸鏈相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá), 從而導(dǎo)致籽粒小、胚致死[11]。盡管這些籽粒發(fā)育相關(guān)基因已被克隆, 但是籽粒發(fā)育的調(diào)控機(jī)制有待于深入研究。本研究將基因定位在1號染色體47.1 Mb~47.4 Mb區(qū)間內(nèi), 包含已克隆基因(Zm00001d028818)。參與玉米籽粒糊粉層細(xì)胞的分化和發(fā)育, 具有21個(gè)跨膜區(qū)域, 1個(gè)胞外環(huán)多肽和1個(gè)半胱氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。該基因突變之后導(dǎo)致胚致死, 影響糊粉層的發(fā)育以及胚乳醇溶蛋白含量的積累[34], 表明的表型很有可能由的等位突變導(dǎo)致。

除之外,的定位區(qū)間還包含4個(gè)候選基因。其中, Zm00001d028813編碼WD40家族蛋白, 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá), 參與植物生長發(fā)育、環(huán)境脅迫響應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)等[35]。Zm00001d028814、Zm00001d028815和Zm00001d028816均編碼病程相關(guān)蛋白基因, 是植物受到病原物侵染或非生物因子刺激后產(chǎn)生的一類蛋白, 參與植物的誘導(dǎo)抗病性[36]。結(jié)合這些基因的功能注釋和表達(dá)譜, Zm00001d028813和Zm00001d028818均有可能是的候選基因, 需要進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論

本研究以玉米DH系選育過程中發(fā)現(xiàn)的籽粒缺陷型突變體()為試驗(yàn)材料, 發(fā)現(xiàn)突變體胚致死、胚乳發(fā)育缺陷, 淀粉粒填充異常。該突變體由隱性單基因控制, 被精細(xì)定位到物理距離約為300 kb的區(qū)間, 包括5個(gè)功能注釋的基因, 其中Zm00001d028813和Zm00001d028818可能為候選基因。

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Phenotypic analysis and fine mapping ofin maize

SONG Xin-Ran1,**, HU Shu-Ting2,**, ZHANG Kai2, CUI Ze-Jin2, LI Jian-Sheng2, YANG Xiao-Hong2, and BAI Guang-Hong1,*

1Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China;2National Maize Improvement Center of China / Key Laboratory of Maize Biology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs / China Agricultural University, Beijing 100193, China

As the storage organ of maize, kernel development and accumulation of storage production directly determines maize yield and quality. In this study, a stable defective kernel mutant, named as(), was identified during the development of double haploid (DH) lines in maize. Thekernels displayed severely shrunk kernel appearance, significantly reduced kernel weight, lethal embryo, defective endosperm and were incapable of germinating. Theshowed obvious developmental abnormalities at 12 days after pollination (DAP). The fresh weight, dry weight and volume of the kernels were no longer increased after 21 DAP. Scanning electron microscopy (SEM) observation revealed that the starch granules ofwere significantly smaller compared with wild-type kernels. Genetic analysis demonstrated that the mutant trait was controlled by a recessive single gene. Using 441 F2individuals and 1648 F3individuals,was narrowed down to a genomic region of about 300 kb between the InDel marker IDP2182 and IDP4600 on chromosome 1, which contains five predicted genes. These results laid the foundation for mining functional genes related to maize kernel development and deciphering the mechanism of grain development.

maize; defective-kernel mutant; fine mapping

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31421005)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31421005).

白光紅, E-mail: bgh601@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

宋欣冉, E-mail: songxinran916@163.com; 胡書婷, E-mail: hushutingcau@163.com

2020-03-17;

2020-07-02;

2020-08-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200818.0903.002.html

10.3724/SP.J.1006.2020.03017