陳 恂，燕曉茹，劉 晶，姚玉璞，張立平

0 引 言

代謝綜合征的核心是肥胖、高血糖、血脂異常和高血壓[1-3]，是心、腦血管病變的病理基礎(chǔ)[4-6]。最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)的代謝綜合征發(fā)病率已上升為33.6%[7]。與此同時(shí)，心腦血管疾病的發(fā)病率也隨之成倍增加[8]。因此，研究代謝綜合征早期血管病變對(duì)于延緩相關(guān)心腦血管病變的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。建立代謝綜合征血管損傷動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。目前，代謝綜合征動(dòng)物模型的構(gòu)建大多通過(guò)飲食誘導(dǎo)來(lái)完成[9-11]，但具體飼料的比例并不統(tǒng)一，缺乏既定的標(biāo)準(zhǔn)。血管損傷模型的構(gòu)建也可通過(guò)飼喂高脂飼料來(lái)建立[12]。此外，對(duì)于代謝綜合征各組分的研究較多，但對(duì)于相關(guān)血管內(nèi)皮功能障礙的研究卻較少。研究發(fā)現(xiàn)，在血糖控制不佳的2型糖尿病患者中，空腹?fàn)顟B(tài)下血清脂肪酸比健康的非糖尿病患者高出50%，餐后的棕櫚酸水平(主要的飽和脂肪酸之一)幾乎比健康的非糖尿病患者高3倍[13]。棕櫚酸能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]，參與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。棕櫚酸作為一種飽和脂肪酸，也常用于制備血管損傷細(xì)胞模型[16]。本課題組前期研究證實(shí)通過(guò)予SD雄性大鼠飼喂自擬高糖高脂高鹽配方飼料能建立代謝綜合征模型[17]，本研究通過(guò)改進(jìn)飼料配方以期建立代謝綜合征血管損傷動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠53只，6～8周齡，體重(200±10)g。來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)： SCXK(京)2016-0006，動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，室內(nèi)溫度：23～25 ℃，相對(duì)濕度(55±10)%，40 W日光燈照射，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜交替光照。隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組14只，模型組39只，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，對(duì)照組以全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，模型組以全價(jià)顆粒飼料混合高糖高脂高鹽飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理遵循3R原則，并通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院倫理委員會(huì)審議(倫理審批號(hào)：201902)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器高鹽高脂飼料定制于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料配方為：50%基礎(chǔ)飼料，10%熟豬油，10%蛋黃粉，2%膽固醇，7.5%奶粉，10%果糖，5%棕櫚油，3%食用鹽，2%魚(yú)粉，0.5%膽鹽。NO Elisa試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司(貨號(hào)：KGE001)，ET-1 Elisa 試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司(貨號(hào)：DET100)，10 kDa超濾管購(gòu)自中國(guó)GE公司(貨號(hào)：Vivaspin 500)，Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：G1340)，油紅o染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：G1260)。大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓儀(Softron BP-98A)、全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日立 7160)，離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模及標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)周期為8周，模型組給予高鹽高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組給予全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，2組均自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)8周末2組按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)選擇7只大鼠，禁食不禁水12 h，采用1%戊巴比妥(40 mg/kg)對(duì)2組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，沿腹壁正中線逐層切開(kāi)腹部，于腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，置于離心機(jī)中4 ℃，離心半徑：20.5 cm，轉(zhuǎn)速：3000 r/min，離心15min，分離上層血清，分裝后于-80 ℃冰箱保存待檢。取血完成后，剪開(kāi)胸腔，于胸腔后壁仔細(xì)剝離胸主動(dòng)脈，切取約1.0 cm左右的胸主動(dòng)脈，用冰等滲鹽水沖洗后置于4%多聚甲醛中固定，切取約0.5 cm左右的胸主動(dòng)脈于凍存管中，直接保存于-80 ℃冰箱中。余大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2體重、Lee′s指數(shù)及體脂率自造模第1天起每周測(cè)量2組大鼠體重。8周末大鼠麻醉后取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，測(cè)量鼻尖至肛門(mén)距離記為大鼠身長(zhǎng)，按公式計(jì)算兩組大鼠Lee′s指數(shù)，公式如下：

Lee’s指數(shù)=體重(g)1/3×103/體長(zhǎng)(cm)[18]

切取并稱重腎周及睪丸周?chē)?，按公式體脂率計(jì)算兩組大鼠體脂率，共同反應(yīng)肥胖程度。公式如下：

體脂率=腎周及睪丸周?chē)?g)/體重(g)×100%[9]

1.3.3血壓實(shí)驗(yàn)8周末，采用Softron無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A進(jìn)行大鼠尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)容積血壓測(cè)定。測(cè)量時(shí)，將大鼠放置在鼠袋中，保持38 ℃恒溫，然后將感應(yīng)器置于大鼠的尾根部，待大鼠處于安靜狀態(tài)下按下開(kāi)始鍵，讀數(shù)記錄。測(cè)定3次，取其平均值作為收縮壓。

1.3.4空腹血糖、血脂水平及血清NO、ET-1全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清空腹血糖(Glu)、三酰甘油(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行NO、ET-1的測(cè)定。

1.3.5血管切片將固定好的血管組織從多聚甲醛中取出，流水過(guò)夜后脫水機(jī)梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm連續(xù)切片行HE 染色及Masson染色；將-80 ℃冰箱保存的血管組織以4 μm連續(xù)切片，100%異丙醇脫水后行油紅o染色，光鏡下觀察大鼠血管病變情況。

2 結(jié) 果

2.1體重、Lee′s指數(shù)和體脂率結(jié)果對(duì)照組大鼠Lee′s指數(shù)、體脂率和收縮壓均明顯低于模型組(P<0.05),見(jiàn)表1。對(duì)照組和模型組大鼠體重均逐漸升高，第3～8周，模型組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表 1 對(duì)照組和模型組Lee′s指數(shù)、體脂率和收縮壓對(duì)比表

2.2空腹血糖、血脂水平和血清NO、ET-18周末，對(duì)照組大鼠血清中Glu、CHO、TG、LDLC、ET-1均低于模型組(P<0.01)，而HDLC、NO明顯高于模型組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

2.3胸主動(dòng)脈病理組織學(xué)改變結(jié)果HE染色結(jié)果表明：對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜均一平滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)扁平，排列規(guī)整，中膜未見(jiàn)增厚，血管平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列規(guī)整，大小均一，模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜欠光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)脫落，中膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞肥大，排列不整，細(xì)胞核大小不一。Masson染色結(jié)果表明：對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈彈力纖維、膠原纖維排列正常，模型組大鼠胸主動(dòng)脈彈力纖維明顯減少，且排列紊亂，膠原纖維明顯增多；油紅o染色結(jié)果表明：模型組大鼠胸主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積明顯多于對(duì)照組。HE染色(內(nèi)膜厚度)、Masson染色及油紅O染色陽(yáng)性面積(膠原纖維和脂滴)發(fā)現(xiàn)，模型組內(nèi)膜厚度、膠原纖維和脂滴的面積均明顯高出對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖1，表4。

表 2 對(duì)照組和模型組體重變化比較

表 3 對(duì)照組和模型組空腹血糖、血脂水平對(duì)比表

圖 1 鏡下觀察對(duì)照組和模型組大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)(×400)

表 4 對(duì)照組和模型組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和膠原纖維及脂滴面積對(duì)比表

3 討 論

代謝綜合征與心腦血管疾病關(guān)系密切,可明顯增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[19-20]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是心血管事件的始動(dòng)環(huán)節(jié)，可能導(dǎo)致胰島素抵抗、血脂紊亂、血壓升高等一系列病理改變，從而可能成為代謝綜合征的早期預(yù)測(cè)因子[21]。對(duì)于代謝綜合征的治療，目前尚無(wú)統(tǒng)一、確切的治療方案,因此早期干預(yù)血管內(nèi)皮功能損傷,或許將成為延緩代謝綜合征患者動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)及其并發(fā)癥的關(guān)鍵[22]。建立合適的動(dòng)物模型是相關(guān)研究開(kāi)展的基礎(chǔ)，但由于早期代謝綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)不一，這給相應(yīng)動(dòng)物模型的構(gòu)建造成困難。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均頒布了統(tǒng)一的代謝綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)[1,23]，均圍繞肥胖、高血壓、高血糖、血脂紊亂四個(gè)代謝綜合征核心成分。診斷標(biāo)準(zhǔn)的制定為動(dòng)物模型的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，本研究亦以此評(píng)價(jià)代謝綜合征建模成功與否。

內(nèi)皮素1(endothelin-1, ET-1)是一種由21個(gè)氨基酸組成，正常生理?xiàng)l件下由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的內(nèi)源性血管收縮肽[24]。ET-1的增加是心血管疾病發(fā)生的重要致病因素[25]，可與細(xì)胞間黏附因子、炎癥細(xì)胞因子一同造成動(dòng)脈粥樣硬化[26]。新近一宗納入76名患者的橫斷面研究同樣發(fā)現(xiàn)[27]：與非代謝綜合征患者相比，代謝綜合征患者血清ET-1的水平顯著升高(P<0.05)。且ET-1水平升高是血管功能紊亂及血脂異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示ET-1是評(píng)價(jià)代謝綜合征血管內(nèi)皮損傷的指標(biāo)。NO是一種重要的血管信號(hào)分子，在調(diào)控血管功能和調(diào)節(jié)血腦屏障中起重要作用[28]。其生物活性和/或生物利用度降低是內(nèi)皮功能障礙的主要原因，也是心血管疾病和2型糖尿病的早期危險(xiǎn)因素[29]。新近研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征相關(guān)的血管內(nèi)皮損傷伴隨NO含量降低，通過(guò)提高NO的含量，可以改善代謝綜合征血管內(nèi)皮損傷，提示NO亦是評(píng)價(jià)代謝綜合征血管內(nèi)皮損傷的指標(biāo)[11]。本課題組既往研究以高糖高脂高鹽飼料飼喂SD大鼠8周成功建立代謝綜合征動(dòng)物模型，并發(fā)現(xiàn)血清炎癥因子(腫瘤壞死因子、白介素-6、核因子κB)及黏附因子(血管細(xì)胞粘附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1)均升高，提示存在血管損傷可能[17,22]。本次研究在前期研究基礎(chǔ)上，調(diào)整飼料配方，加入富含棕櫚酸的棕櫚油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組39只大鼠，除2只體重不達(dá)標(biāo)(低于對(duì)照組平均體重)，2只測(cè)量血壓時(shí)窒息死亡，余35只均造模成功，模型成功率為89.74%。8周末模型組大鼠較對(duì)照組出現(xiàn)明顯的肥胖、高血壓、高血糖和血脂紊亂，滿足代謝綜合征動(dòng)物模型。在血管損傷方面，模型組大鼠血清NO較對(duì)照組明顯降低，ET-1明顯升高；血管病理染色顯示明顯內(nèi)膜增厚，膠原纖維和脂滴沉積，可見(jiàn)血管損傷明顯，提示造模成功。

研究中應(yīng)當(dāng)注意：①動(dòng)物適口性的問(wèn)題，當(dāng)通過(guò)逐步替代的方法使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)高糖高脂高鹽飼料；②油脂含量高的飼料質(zhì)地較軟，不適嚙齒類(lèi)動(dòng)物啃咬，長(zhǎng)期飼喂可能造成牙齒過(guò)尖長(zhǎng)而不能進(jìn)食，當(dāng)提供小木棒幫助磨牙；③高脂飼料容易變質(zhì)酸化，影響進(jìn)食，飼料給予當(dāng)少量多次，保證口感；④基礎(chǔ)飼料和造模飼料中的基礎(chǔ)飼料當(dāng)保持一致，不同飼料公司提供的基礎(chǔ)飼料可能會(huì)有差異。本研究仍存如下問(wèn)題：①高糖高脂高鹽飼料未能明確各營(yíng)養(yǎng)組分，不利于今后各營(yíng)養(yǎng)素和機(jī)體代謝關(guān)系的研究；②為增加進(jìn)食量，飼料中的棕櫚油以人造黃油的形式提供，不能排除食品添加劑對(duì)研究的影響；③僅動(dòng)態(tài)觀測(cè)體重變化，余指標(biāo)未能動(dòng)態(tài)觀測(cè)，忽略了實(shí)驗(yàn)時(shí)間被縮短的可能。今后研究將進(jìn)一步明確造模飼料各營(yíng)養(yǎng)組分的配比情況，優(yōu)化飼料組分，并增加相關(guān)指標(biāo)的觀測(cè)時(shí)間窗，找尋最優(yōu)飼喂時(shí)長(zhǎng)，為代謝綜合征血管損傷動(dòng)物模型的建立提供合適、經(jīng)濟(jì)的方法。代謝綜合征血管損傷動(dòng)物模型的建立可為相關(guān)研究提供支持，有利于早期干預(yù)代謝綜合征預(yù)防相關(guān)心腦血管疾病的研究。