陳文龍 ，舒維 ，湯旭惠 ，肖翔宇 ，傅強

（1.江西省人民醫(yī)院急診科，南昌 330006；2.江西省胸科醫(yī)院中西醫(yī)結合呼吸科，南昌 330006）

百草枯（PQ）是一種全球廣泛應用的除草劑，誤服、皮膚粘膜接觸、氣道吸入等都可造成急性中毒，致死劑量小，是中毒病死率最高的農(nóng)藥。PQ吸收入人體后，在肺內(nèi)聚集，較大劑量可短時間引起急性肺損傷，呼吸衰竭，多臟器功能損傷。PQ中毒機制目前普遍認為和炎癥爆發(fā)及氧化應激等相關[1]。PQ中毒治療目前無特效對抗藥和解毒劑，仍處于探索階段[2，3]。黃連素，主要由中藥黃柏、黃連提取，又稱鹽酸小檗堿（berberine，BBR），具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，具有抑菌作用，廣泛應用于腸道感染。近些年，大量研究發(fā)現(xiàn)黃連素在調(diào)節(jié)血糖、血脂、控制心律失常、抑制炎癥反應、抗腫瘤等具有顯著效果，對心臟、腎臟、肝臟具有較強的臟器保護作用[4，5]。本研究采用黃連素干預PQ中毒大鼠，探索黃連素對PQ中毒大鼠急性肺損傷的影響及機制，以期為PQ中毒治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD 大鼠40只，由南昌大學醫(yī)學院動物實驗部提供，體重為300-400g，普通級，隨機分為正常對照組 （Ctrl）、中毒模型組（PQ）、黃連素低劑量組（PQ+LBBR）、黃連素高劑量組（PQ+HBBR），共4組，每組10只。

1.2 材料 質(zhì)量濃度為20%PQ濃縮液 （上海先正達有限公司），黃連素（長春新安藥業(yè)有限公司公司），TNF-α、IL-1β、MDA、SOD、考馬斯亮藍檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實驗方法 PQ組、PQ+LBBR組、PQ+HBBR組大鼠，采用PQ一次性灌胃染毒法（40 mg/kg）復制PQ中毒模型[6]。PQ+LBBR組、PQ+HBBR組大鼠染毒后分別予以40 mg/kg、150 mg/kg黃連素灌胃，1次/d，連續(xù)3d[7]。Ctrl組、PQ組以相等劑量溶媒（0.5%CMC-Na）胃內(nèi)灌入，1 次/d，連續(xù) 3d。

1.4 觀察指標 72h后觀察大鼠的一般情況，選用10%水合氯醛（4.5mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠開胸后暴露肺和心臟，取采血針穿刺入心臟，采取5ml血液，留取血漿檢測TNF-α和IL-1β含量。采集血液后，充分暴露并切開氣管，將灌胃針插入氣管，深度約5mm，予以手術線固定，采用生理鹽水灌洗，每次2ml，共2次?；厥罩夤?肺泡灌洗液（BALF）進行白細胞計數(shù)、測定蛋白含量。剪下整個肺臟，觀察肺臟的大體情況，分離大鼠肺組織，取大鼠右肺中葉用4℃生理鹽水沖洗，用濾紙將水吸干，稱濕重（W），然后將肺組織置于80℃烘干48h，稱干重（D），計算肺W/D比值。切取右肺后葉肺組織打漿、離心，硫代巴比妥酸（TBA）法測定勻漿內(nèi)MDA含量，黃嘌呤氧化酶（羥胺）法測定肺組織勻漿內(nèi)SOD活力，取左側肺組織10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計學處理 實驗結果用表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS19進行分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA），組間兩兩比較應用SNK-q檢驗，方差不齊選用Dunnett’s T3檢驗，以P＜0.05表示有統(tǒng)計差異。

2 結果

2.1 72h后大鼠一般情況 Ctrl組大鼠毛發(fā)干凈、光亮、能快速活動、呼吸平穩(wěn)、能正常飲食。PQ組大鼠毛發(fā)蓬松、無光澤、皮膚發(fā)紺、活動緩慢、呼吸急促、飲食減少，部分有腹瀉癥狀。PQ+LBBR、PQ+HBBR組大鼠與PQ組相比，其中毒癥狀相對較輕。

2.2 大鼠血清 TNF-α、IL-1β、及肺組織勻漿MDA、SOD含量變化 與 Ctrl組比較，PQ組中TNF-α、IL-1β及MDA含量明顯高于Ctrl組，SOD含量明顯低于Ctrl組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）； 與 PQ 組比較，PQ+LBBR、PQ+HBBR 組中TNF-α、IL-1β及 MDA含量較PQ組明顯降低，SOD含量明顯增高，有顯著差異 （均P＜0.05）；與PQ+LBBR 組比較，PQ+HBBR 組中 TNF-α、MDA含量較PQ+LBBR組明顯降低，SOD含量明顯增高，差異顯著（均 P＜0.05），見表 1。

表1 大鼠血清TNF-а、IL-6、及肺組織勻漿MDA、SOD含量變化（）

表1 大鼠血清TNF-а、IL-6、及肺組織勻漿MDA、SOD含量變化（）

注：與 Ctrl組比較，# 代表 P＜0.05；與 PQ 組比較，* 代表 P＜0.05；與 PQ+LBBR 組比較，△P＜0.05

TNF-α（ng/L）45.00±4.58 104.10±9.55#93.00±6.93＊82.06±5.85＊△組別IL-1β（ng/L） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）Ctrl PQ PQ+LBBR PQ+HBBR例數(shù)10 10 10 10 153.76±7.43 189.36±9.76#177.919±8.39＊169.30±8.34＊7.10±1.04 14.96±2.03#12.13±1.56＊10.14±1.48＊△25.05±2.39 14.30±1.53#15.97±1.68＊18.32±2.14＊△

2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數(shù)、蛋白含量、肺組織W/D比值比較：PQ組中BALF白細胞總數(shù)、蛋白含量及肺組織W/D比值明顯高于Ctrl組 （均 P＜0.05）；PQ+LBBR、PQ+HBBR 組中白細胞總數(shù)、蛋白含量及肺組織W/D比值均明顯低于PQ組（均P＜0.05）；PQ+HBBR組中白細胞總數(shù)、蛋白含量及肺組織W/D比值均明顯低于PQ+LBBR 組（均 P＜0.05），見表 2。

2.4 肺臟的大體情況 Ctrl組大鼠雙肺表面粉色、無出血點、未見水腫、觸之光滑、柔軟；PQ組大鼠雙肺表面呈不均勻暗紅色、可見明顯充血水腫、有點狀和片狀出血灶、表面粗糙；PQ+LBBR、PQ+HBBR組雙肺表面可見充血腫脹、少量出血點。

表2 肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比及蛋白含量變化（）

表2 肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比及蛋白含量變化（）

注：與 Ctrl組比較，# 代表 P＜0.05；與 PQ 組比較，* 代表 P＜0.05；與PQ+LBBR 組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) BALF WBC（×106）Protein content(mg/L) 肺組織W/D 3.28±0.39 6.57±0.66#5.65±0.58#＊5.01±0.67#＊△Ctrl PQ PQ+LBBR PQ+HBBR 10 10 10 10 87.88±7.45 166.84±13.50#151.86±12.85#＊135.59±9.79#＊△103.97±10.00 219.34±14.36#198.00±15.15#＊178.00±14.49#＊△

2.5 肺組織病理及病理圖 Ctrl肺組織形態(tài)結構正常；PQ組肺泡水腫充血、肺泡間質(zhì)增厚、肺泡間隙聚集大量炎癥細胞、毛細血管充血；PQ+LBBR、PQ+HBBR組肺組織損傷較PQ組減輕，見圖1-4。

肺組織病理圖

圖1 Ctrl組HE*200

圖2 PQ組 HE*200

圖3 PQ+LBBR組HE*200

圖4 PQ+HBBR組 HE*200

3 討論

PQ通過皮膚、黏膜、胃腸道和呼吸道等部位吸收，引起急性肺損傷，呼吸衰竭，PQ中毒機制尚未明確[1]。大量研究證實，氧化應激是PQ中毒急性肺損傷的主要機制之一。PQ進入肺組織后，經(jīng)NADPH還原作用等生成大量百草枯單陽離子自由基（PQ+）、超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基等氧自由基。氧自由基通過損傷線粒體膜、脂質(zhì)過氧化損傷細胞膜，破壞細胞功能結構，導致細胞凋亡[8，9]。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素能降低PQ中毒大鼠肺組織勻漿MDA含量，提高肺組織勻漿SOD含量，且較大劑量作用更強，這表明黃連素能抑制PQ中毒肺組織氧化應激，且可能呈劑量依賴性。

炎癥爆發(fā)也是PQ中毒急性肺損傷的主要機制，PQ在肺組織中聚集后刺激巨噬細胞和上皮細胞釋放大量炎癥因子如TNF-α、IL-1β和干擾素（IFN-γ）等，引發(fā)炎癥反應，導致中性粒細胞和單核巨噬細胞等炎性細胞聚集，血管通透性增加，引起急性肺損傷[10]。此外，氧化應激與炎癥反應是相互影響和促進的[11]。Park，MH等[12]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β是炎癥表達過程中的重要因子。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素能降低PQ中毒大鼠血清TNF-α、IL-1β含量，較大劑量作用更明顯，這表明黃連素能抑制PQ中毒急性肺損傷的炎癥反應，且可能呈劑量依賴性。

黃連素為傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏等的提取物，作為抑菌劑在臨床中廣泛應用，且價格低廉，不良反應少。近些年黃連素在抗氧化應激、炎癥反應等方面進行了廣泛研究。馬競等[7]研究LPS誘導的腦損傷大鼠發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制LPS誘導的細胞凋亡、氧化應激、炎癥和NF-細胞的激活，而對大鼠腦損傷發(fā)揮保護作用。Wang，Y等[13]體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制NF-細胞和IL-6介導的STAT3激活，在脂多糖誘導的膿毒癥中充當負調(diào)節(jié)劑。Jin，JL等[14]實驗證實黃連素可改善膿毒癥大鼠的心肌損傷和心臟功能，其機制可能與抑制LPS誘導的TLR4/NF-κB信號通路的激活并進一步減少TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生有關。Li，Z等[15]研究發(fā)現(xiàn)BBR通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制PC-12細胞中的氧化應激和線粒體功能障礙，從而保護叔丁基氫過氧化物（t-BHP）誘導的細胞毒性。Kazaz，I O等[16]動物實驗發(fā)現(xiàn)黃連素通過降低氧化應激抑制缺血再灌注引起的大鼠睪丸損傷。本研究采用黃連素干預PQ中毒大鼠，通過觀察72h后大鼠的一般情況，肺泡灌洗液的白細胞計數(shù)和蛋白，肺組織勻漿MDA、SOD含量，血漿TNF-漿和IL-1漿含量，肺組織干濕比值，肺組織病理等指標并與對照組比較。證實黃連素能減輕PQ中毒大鼠氧化應激及炎癥反應，對急性肺損傷具有保護作用。

綜上所述，黃連素能減輕PQ中毒大鼠的炎癥反應及過氧化損傷，對PQ中毒大鼠急性肺損傷具有保護作用，較大劑量組效果更明顯。這為黃連素在新的領域應用提供了一定的研究基礎，也為尋找PQ中毒新的治療方法，改善中毒治療效果提供了理論依據(jù)。