黃舒穎 ，張艷 ，陳鵬飛 ，張誠(chéng) ，黃自坤 ，羅清 ，卿城

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，1.生殖科；3.藥學(xué)部；4.超聲科；5.檢驗(yàn)科；6.重癥醫(yī)學(xué)科，南昌 330006；2.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院護(hù)理系，南昌 330052）

膿毒癥是由感染原因造成的失控性全身炎癥反應(yīng)，往往在短時(shí)間內(nèi)就可形成危及生命的器官功能損害。雖然對(duì)于膿毒癥致病機(jī)理的研究在不斷深入，治療手段和理念也在不斷更新，但膿毒癥的死亡率仍然處于較高水平，是當(dāng)前重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

過度炎癥反應(yīng)是膿毒癥早期重要的病理生理特點(diǎn)，巨噬細(xì)胞在此過程中發(fā)揮重要作用[1]。合理調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能，對(duì)于膿毒癥治療具有重要意義。作為傳統(tǒng)名貴中藥材人參主要活性成分之一的人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1），經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究表明，具有良好的抗炎、抗氧化等多種作用[2]。深入研究人參皂苷Rg1在膿毒癥疾病過程中對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，具有重要的科研和臨床價(jià)值。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200nt的非編碼RNA，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后評(píng)估中具有重要作用[3]。我們以往研究表明，膿毒癥病人PBMC細(xì)胞內(nèi)lncRNA NEAT1（以下簡(jiǎn)稱NEAT1）表達(dá)上升[4]；結(jié)核菌感染RAW264.7巨噬細(xì)胞可促進(jìn)NEA T1表達(dá)上調(diào)，沉默NEAT1可減弱巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)結(jié)核菌清除能力[5]。即NEAT1是一個(gè)炎癥反應(yīng)相關(guān)分子，推測(cè)其與膿毒癥免疫功能密切相關(guān)?；谝陨险J(rèn)識(shí)，我們?cè)隗w外通過內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)建體外膿毒癥炎癥反應(yīng)模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，以及對(duì)NEAT1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 LPS（美國(guó)sigma公司）；人參皂甙Rg1（北京生物制品檢定所）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清 （中國(guó)杭州四季青公司）；TRIzol試劑和LipofectmineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；PCR引物 （中國(guó)上海生工生物工程公司）；IL-6 ELISA試劑盒 （上海明睿生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物TaKaRa公司）。其它所用試劑均為分析純。

1.1.2 細(xì)胞系 RAW264.7巨噬細(xì)胞系，購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.1.3 儀器 熒光定量 PCR儀器 （美國(guó)ABI公司Applied Biosystems 7600系統(tǒng)）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo）；酶標(biāo)分析儀（美國(guó) Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7巨噬細(xì)胞種植在含10%胎牛牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d換液或傳代一次。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞加入24孔板，貼壁培養(yǎng)1h，隨機(jī)進(jìn)行分組：⑴對(duì)照組：未經(jīng)Rg1和LPS處理；⑵LPS組：加入終濃度10 mg/L的LPS培養(yǎng)6h；⑶Rg1+LPS組：終濃度為5、50μmol/L的Rg1預(yù)處理12h 后，分別加入 LPS（終濃度 0.1μmol/L），6h 后分別收集各組分細(xì)胞和培養(yǎng)上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 細(xì)胞用胰酶消化，按1×104cells/well種植于96孔板，細(xì)胞融合到80%左右時(shí)吸去上清液，各孔加20μl MTT溶液，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，每個(gè)孔再加入150μl DMSO，避光震蕩10 min讓藍(lán)色結(jié)晶體充分溶解，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞OD值。

1.2.4 IL-6蛋白測(cè)定 細(xì)胞用胰酶消化，按照1×106cells/well種植于96孔板，各組分別加入相應(yīng)成分，按上述1.2.2時(shí)間點(diǎn)結(jié)束培養(yǎng)，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)培養(yǎng)上清液IL-6濃度。

1.2.5 IL-6 mRNA和lncRNA NEAT1測(cè)定RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-6 mRNA和lncRNA NEAT1表達(dá)，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按TakaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將細(xì)胞中RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；PCR引物購(gòu)買于上海生工生物公司。以GAPDH為內(nèi)參基因，各基因引物序列如下：GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'， 下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。NEAT1上游引物：5'-CTTCCTCCCTITAACTTATCCATTCAC-3'，下游引物 ：5'-CTCTTCCTCCACCATTACCAAC AATAC-3'[6]。 IL-6 上游引物：5′-AAACTAGTGAA ATATATCCTGTTGTCAGG-3′， 下游引物序列：5′-GGAAGCTTCCAACATTCATATTGTCAGTTC-3′[7]。qPCR反應(yīng)采用SYBR Premix EX TaqTM II，使用ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)，具體的檢測(cè)步驟及反應(yīng)條件設(shè)置都按照試劑盒說明書進(jìn)行。所有樣品做3副孔，RNA相對(duì)表達(dá)量以 2-△△Ct方法計(jì)算所得。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以()表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞存活率影響 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，與LPS組比較，50μmol/L的人參皂苷Rg1可提高巨噬細(xì)胞存活率，見表1。

表1 Rg1對(duì)LPS所致巨噬細(xì)胞存活率的影響

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子IL-6蛋白分泌和mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS刺激巨噬細(xì)胞后，IL-6蛋白和mRNA較空白對(duì)照組表達(dá)顯著上調(diào)。加入Rg1后，與LPS組比較，5μmol/L低濃度組Rg1對(duì)LPS所致巨噬細(xì)胞IL-6蛋白和mRNA表達(dá)無明顯影響；50μmol/L Rg1組可顯著下調(diào)IL-6蛋白和mRNA表達(dá) (P＜0.05)，見表2。

表2 Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞IL-6蛋白和mRNA影響（n=3,）

表2 Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞IL-6蛋白和mRNA影響（n=3,）

與 LPS 組比較：*P＜0.05；**P＜0.01

1.0±0.1 12.5±3.2 11.8±3.1 5.6±1.7*項(xiàng)目 IL-6（pg/ml） IL-6 mRNA 倍數(shù)空白對(duì)照組LPS組Rg1（5μmol/L）+LPS 組Rg1（50μmol/L）+LPS 組72.7±8.9 385.5±59.6 357.5±48.4 190.5±19.7**

2.3 人參皂苷 Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞lncRNA NEAT1表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS刺激巨噬細(xì)胞后，NEAT1較空白對(duì)照組表達(dá)顯著上調(diào)。加入Rg1后，與LPS組比較，5μmol/L低濃度組Rg1對(duì)LPS所致巨噬細(xì)胞NEAT1表達(dá)無明顯影響；50μmol/L Rg1組可顯著下調(diào) NEAT1表達(dá) (P＜0.05)，見表 3。

表3 Rg1對(duì)LPS所致巨噬細(xì)胞NEAT1表達(dá)影響()

表3 Rg1對(duì)LPS所致巨噬細(xì)胞NEAT1表達(dá)影響()

與 LPS 組比較：*P＜0.05

1.0±0.1 6.8±2.7 5.9±2.1 2.5±1.1*項(xiàng)目 NEAT1倍數(shù)空白對(duì)照組LPS組Rg1（5μmol/L）+LPS 組Rg1（50μmol/L）+LPS 組

3 討論

根據(jù)美國(guó)賓夕法尼亞州大學(xué)2018年在危重病醫(yī)學(xué)雜志發(fā)布的一篇研究報(bào)告顯示，從2010年到2015年，膿毒癥在內(nèi)科和外科住院患者中所占的比例從3.9%上升到9.4%，30天的住院再入院率從2010年的26.4%小幅下降到2015年的23.1%[8]。國(guó)內(nèi)北京協(xié)和醫(yī)院杜斌教授的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，我國(guó)外科ICU及綜合ICU的嚴(yán)重膿毒癥患病率分別為8.7%和37.3%，與來自歐洲的數(shù)據(jù)相近，由膿毒癥造成的死亡人數(shù)占12.6%[9]。面對(duì)膿毒癥如此高的發(fā)病率和死亡率，不得不引起醫(yī)學(xué)界在臨床科研上的高度重視。

巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫在膿毒癥病理生理過程中扮演關(guān)鍵角色，它作為一種固有免疫細(xì)胞，廣泛分布于體內(nèi)各器官、系統(tǒng)，在受到致病微生物感染時(shí)，既能吞噬殺滅細(xì)菌，又能通過釋放炎癥介質(zhì)、趨化因子招募更多炎癥細(xì)胞，放大炎癥反應(yīng)；還能根據(jù)所處微環(huán)境變化，選擇性極化為促炎的“M1表型”或抑炎的“M2表型”，因而巨噬細(xì)胞是機(jī)體連接固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要橋梁[10，11]。在膿毒癥早期，巨噬細(xì)胞識(shí)別炎癥刺激分子，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，大量釋放炎癥因子。我們的研究表明，LPS刺激巨噬細(xì)胞6h后，促炎細(xì)胞因子IL-6在蛋白和mRNA水平明顯上調(diào)，促炎癥反應(yīng)過程被啟動(dòng)。

在炎癥反應(yīng)過程中，既有炎癥因子的上調(diào)，也伴有促炎基因的表達(dá)上調(diào)。lncRNA是今年來炎癥免疫研究新的亮點(diǎn)和熱點(diǎn)。如lncRNA CD244可調(diào)控結(jié)核感染過程中CD8+T細(xì)胞IFN-γ和TNF-α分泌[12]；lncRNA GAS5可促進(jìn)巨噬細(xì)胞呈M1極化[13]。NEAT1也是一個(gè)重要的促炎型炎癥調(diào)控分子，在THP-1免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)它可以調(diào)節(jié)炎癥因子IL-6、CXCL10表達(dá)[14]。我們課題組在研究結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)，H37Rv感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后可促進(jìn)NEAT1表達(dá)上調(diào)，下調(diào)NEAT1表達(dá)可減弱巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)H37Rv清除能力[6]。新晉吳緬教授課題組研究還發(fā)現(xiàn)[15]，N EAT1可以直接參與炎癥小體的組裝和激活，促進(jìn)炎癥因子IL-1β分泌。另有多篇文獻(xiàn)報(bào)道RAW264.7細(xì)胞中，NEAT1下調(diào)可抑制炎癥因子IL-6在蛋白和mRNA水平的表達(dá)[16，17]。我們研究表明，促炎分子NEAT1在LPS刺激情況下表達(dá)上調(diào)，與炎癥反應(yīng)過程同步。

抑制過度炎癥反應(yīng)，一直是膿毒癥科研和臨床治療的重要方向之一。中醫(yī)藥治療膿毒癥，在2014年寫進(jìn)了中國(guó)膿毒癥治療指南[18]。我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]及以往的科研經(jīng)歷，選擇了具有抗炎活性的傳統(tǒng)中藥單體活性成分人參皂苷Rg1。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，人參皂苷Rg1一方面能改善LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞存活率降低。另外一方面對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用，表現(xiàn)為IL-6和NEAT1表達(dá)下調(diào)。表明人參皂苷Rg1的抗炎機(jī)制中，既可以抑制炎癥因子表達(dá)，也能調(diào)控促炎基因NEAT1表達(dá)，進(jìn)一步豐富了人參皂苷Rg1抗炎機(jī)理。

綜上，本研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)毒素可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-6和促炎因子NEAT1表達(dá)上調(diào)；中藥單體成分人參皂苷Rg1具有抗炎作用，其機(jī)制可能與抑制IL-6和NEAT1表達(dá)有關(guān)，該研究為膿毒癥科研提供新的思路。