王蔚，楊青，況九龍，葉小群

（南昌大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，南昌 330006）

平滑肌特異性蛋白(smoothelin)是一種特殊類型的細胞骨架蛋白，表達于終末分化的、收縮的平滑肌細胞。目前研究表明其基因SMTN的表達減少與平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)從收縮到增殖的表型調節(jié)有關，可作為SMC表型轉換的標記物[1]，但其與慢性阻塞性疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)之間的關系尚不清楚。研究者通過前瞻性臨床觀察隊列研究，收集268例不同嚴重程度COPD患者的SMTN基因多態(tài)分析資料與臨床特征，探討人類SMTN基因單核苷酸多態(tài)性與COPD患者的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2017年1月至2017年8月在我院呼吸科住院治療的COPD患者共268例，其中男202 例，女 66 例；平均年齡（71.7±8.9）歲，男（71.2±9.2）歲，女（73.3±7.8）歲。 后對所有患者進行一年隨訪，期間有94例患者再發(fā)急性加重;其中大多數(n＝74，78.72%)在一年的隨訪中經歷過一次急性加重事件，其他患者至少出現過兩次或以上的急性加重事件(n＝20，21.28%)，這其中包括 14 例死亡患者(14.89%)。疾病診斷標準符合全球阻塞性肺病肺活量測定標準。一般吸煙者定義為每天吸煙≥1支，累計超過6個月。吸煙指數(smoking index，SI)＝每天吸煙數×吸煙年數。入組時提取社會人口信息、實驗室檢驗、肺功能及心臟超聲檢查。排除標準：合并有哮喘、支氣管擴張、左心室功能障礙、特發(fā)性肺動脈高壓、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化相關疾病和其他周圍血管疾病。所有患者在隨訪期間接受適當的藥物、和/或長期氧療、無創(chuàng)通氣支持治療[2]。

這項研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準；每個患者在入組前都簽署了知情同意。

1.2 方法 在國家生物技術信息中心SNP數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)中，共有301個人類SMTN基因的單核苷酸多態(tài)性。課題組還篩選了國際hapmap項目網站(www.hapmap.nc)上列出的標簽SNP的數據；同時還參考了之前在NCBI、Celera Discovery SystemTM(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）注冊的SNP等位基因頻率信息和國際單倍型圖項目。在這些基因信息數據庫中發(fā)現有5個單核苷酸多態(tài)性在作為遺傳關聯實驗的標記物時，小等位基因頻率(maf)大于0.15?；谝陨涎芯勘尘?，本課題組篩選了5個單核苷酸多態(tài)性(rs2074738，rs5997872，rs56095120，rs9621187 和rs10304)作為研究對象。其中，rs5997872為外顯子，rs10304位于3’非翻譯區(qū)(UTR)，其余三個 SNP為內含子。從患者外周血中提取DNA后，采用PCR-連接酶檢測反應法進行基因分型。利用引物對五個目標單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行PCR擴增。PCR產物使用ABI3730XL DNA測序儀進行分析，并對具有代表性的產物進行直接DNA測序以證實準確性。

1.3 統計學分析 所有變量均以均值±SD表示。采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，P＜0.05（雙側）提示呈現顯著差異。使用卡方檢驗分析分類變量的差異、對對照組進行Hardy-Weinberg平衡(HWE)分析、評價基因型分布和等位基因頻率。采用無條件Logistic回歸模型估計基因型特異性風險的概率比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)。

2 結果

2.1 COPD患者臨床特征分析 急性加重組與穩(wěn)定組之間身體質量指數 (body mass index，BMI)(19.15±2.83vs20.35±2.74，kg/m2，P＝0.0184)（圖 1）、血清肌酐 (serum creatinine，Scr)(83.52±27.57vs73.14±23.52，umol/l，P＝0.0309)（圖 2）、 及肺功能一秒率（第一秒用力呼氣容積/預計值，forced expiratory volume in one second/prediction，FEV1%） (35.27±15.04vs42.03±17.66，P＝0.0280)（圖 3） 有顯著性差異。吸煙狀況、年齡、收縮壓 (SBP)、B型腦鈉肽(BNP)、谷草轉氨酶(AST)、空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧分壓(PaO2)及心臟超聲結果（如右房左右徑、右室內徑、肺動脈內徑、三尖瓣返流速度），在兩組間無顯著差異（部分數據見表1）。

表1 患者臨床特征

2.2 SMTN基因多態(tài)性等位基因頻率 在急性加重組與穩(wěn)定組中，rs2074738基因型分布在總體人群(P＝0.037)和在男性中(P＝0.013)的顯性模型分布有顯著差異。在急性加重組中，rs2074738的GG基因型明顯顯示出更高的頻率。這些模型的顯性和隱性由它們在受試者中的頻率來定義（見表2）。

2.3 SMTN基因多態(tài)性rs2074738與COPD再發(fā)急性加重的相關性 使用下列變量進行Logistic回歸：SBP、Scr、FBG、TC、年齡、PaO2和吸煙狀況。 與急性加重相關的rs2074738的GG基因型在總體人群(OR＝2.613，95%CI＝1.059-6.444，P＝0.037)、特別是男性患者 (OR＝4.091，95%CI＝1.358-12.318，P＝0.0123)之間有顯著性差異。同時在男性中觀察到其他環(huán)境因素：FBG(OR＝1.34，95%CI＝1.053-1.704，P＝0.0173)和年齡(OR＝1.067，95%CI＝1.008-1.130，P＝0.0257)對急性加重有影響（見表 3）。

3 討論

在隨訪1年的研究中，研究者評估了SMTN基因多態(tài)性與COPD急性加重的關系。在基線臨床特征上，BMI是COPD急性加重的一個預警指標[3]。FEV1%是反映COPD患者肺功能最重要的指標，它的數值下降可對急診急性加重患者的救治效果產生顯著影響[4]。本研究對基線特征的分析也發(fā)現，反復急性加重組患者的基線BMI值、Scr和FEV1%均明顯低于穩(wěn)定組；提示低體重、低血清肌酐和低一秒率水平，和COPD反復急性加重明顯相關。同時研究發(fā)現在其他臨床特征大致相同的情況下，反復發(fā)作患者的SMTN基因單核苷酸rs2074738的基因型和等位基因頻率的總體分布有顯著差異；而且在吸煙狀況、PaO2、血壓等外在環(huán)境因素無差異的情況下，SMTN基因單核苷酸rs2074738的GG基因型與COPD急性加重成正相關，可作為急性加重事件的獨立的預測標記物。在攜帶GG基因型的個體中，急性加重的風險高出2.613倍；尤其在男性患者中，該風險高出4倍。此外，研究者還發(fā)現一些環(huán)境因素可以影響COPD的惡化?？崭寡巧吆湍挲g增加可能增加COPD再發(fā)急性加重的風險，這與臨床過程一致。

表2 急性加重組與穩(wěn)定組的基因型及等位基因分布

表3 急性加重組GG基因型rs2074738混雜因素的Logistic回歸分析

基因多態(tài)性在闡明人體對疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現的多樣性、以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。通過基因多態(tài)性的研究，可從基因水平揭示在不同個體間生物活性物質的功能及效應存在差異。真實世界研究提示COPD人群易感性與不同基因的基因多態(tài)性之間存在某種聯系，如曾有研究提示去整合素基質金屬蛋白酶19 rs1422795位點基因多態(tài)性與CO PD無明顯相關性，可能不是COPD的易感基因[5]。盡管如此，對于COPD肺血管SMC損傷、及其表型改變的研究未曾涉及。COPD患者肺內出現低氧血癥可引起中膜血管SMC和外膜成纖維細胞過度增殖、以及細胞外基質蛋白沉積而導致持續(xù)的血管收縮，從而誘導血管重構[6]。血管SMC在包括缺氧等各種病理或生化的刺激下，可以可逆地從終末分化的、收縮表型轉換為增殖的、遷移的合成表型，調節(jié)呼吸系統的血管張力和功能[7-9]。而終末分化（即收縮功能）的SMC中存在SMTN基因的特異性表達；未分化的（即增殖的）SMC中該基因則很少表達。動物研究發(fā)現SMTN基因敲除的小鼠壽命較短，腸平滑肌收縮減少，胃腸蠕動受損[10]。早期冠狀動脈粥樣硬化的冠脈中層細胞增殖伴隨SMTN低表達[11]。在體研究發(fā)現SMTN基因可預測高血壓、腦血管疾病的血管重構過程[12，13]。其他國外研究提示SMTN基因型可作為疾病發(fā)生的易感標記物，其基因中具有保護作用的G-C-A-C單倍型可能是原發(fā)性高血壓的遺傳標記[14]；C-T-T-A單倍型可能是日本男性患者發(fā)生急性腦梗塞的易感標記物，而C-A-T-G單倍型可能是保護性標記[15]。這些結果表明SMTN基因可能通過血管構型的改變參與了多種疾病的發(fā)生過程，本研究則發(fā)現其可作為COPD急性加重患者、尤其是男性患者頻繁發(fā)作的易感因素。

總之，雖然COPD急性加重是一個復雜、多因素作用的結果，我們的研究表明血管構型改變參與了急性加重的過程，SMTN基因作為血管表型轉換的標記物，其單核苷酸rs2074738與COPD急性加重之間有很強的相關性；rs2074738 GG基因型可能是老年男性COPD頻繁發(fā)生急性加重事件的標記物。本研究為對進一步了解COPD急性加重的病理機制提供一種新的思路，同時也為以后對涉及血管相關通路的靶向治療提供參考。

本課題存在一定局限性。在本研究人群中，男性患者占75.4%，盡管有研究證實男性是因頻繁急性加重而反復就診的顯著預測因子[15]，但少樣本量的研究對論證SMTN的rs2074738 GG型在全體人群中的預測作用的證據尚不充分。為了確認本研究的可靠性，需要更多的人口調查數據。

致謝：江西省衛(wèi)生廳（20175289），國家自然科學基金 (81860011,COPD血清外泌體小RNA分子標志物的篩選及其在上皮-間質轉化中的作用及機制研究）支持這項研究。

利益沖突：無