陸婷，倪 銘，夏秀秀，劉立明，趙翠青2,，金寧一

(1．溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035；2．溫州大學病毒學研究所，浙江溫州 325035；3．溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江溫州 325035；4．吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林 132101)

酒精性肝?。ˋLD）是指由于長期大量飲酒所導致的一系列肝臟疾病，是僅次于病毒性肝炎的第二大類肝?。凭诟闻K中代謝可引起氧化應激，影響肝臟脂質代謝誘使脂質堆積，脂質過氧化和炎癥反應會進一步引起肝細胞的炎癥、壞死、纖維化以及硬化，表現(xiàn)為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化并最終可發(fā)展為肝癌[1]．益生菌是一類對宿主健康有益的活性微生物，早在1907年就有研究提出攝入活性微生物對人體有益的觀點[2]．LGG（鼠李糖桿菌GG株，Lactobacillus Shamnosus GG Strain，簡寫為Lactobacillus GG或LGG），是目前應用最多的益生菌之一，我們的前期研究表明，LGG及其培養(yǎng)上清對酒精引起的肝損傷均有保護作用[3-4]．本研究使用LGG對小鼠連續(xù)預處理4周時間，建立小鼠急性肝損傷模型，通過實驗進一步闡明了LGG對急性酒精性肝損傷保護的作用機制，即LGG對急性酒精性肝損傷的保護作用是通過調節(jié)肝臟脂質代謝實現(xiàn)的．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物

選購6 – 8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重18 – 22 g，購自南京君科生物工程有限公司．飼養(yǎng)期間自由采食．所有動物實驗均經溫州醫(yī)科大學動物實驗中心和倫理委員會批準，許可證編號為SYXK（浙）2015-0009．

1.1.2 菌 株

鼠李糖乳桿菌GG（LGG），購于美國ATCC菌種保藏中心．

1.1.3 試 劑

MRS瓊脂及肉湯培養(yǎng)基（海博生物），谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），谷草轉氨酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所），甘油三酯（TG）檢測試劑盒（Abcam），UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司），反轉錄試劑盒（寶牌），SYBR-Green實時熒光定量PCR預混液（Applied Biosystems），蘇木素伊紅染色試劑盒（碧云天），中性樹膠（索萊寶），脫脂牛奶（BD），30%丙烯酰胺（索萊寶），Trisbase（索萊寶），BCA蛋白的測定試劑盒（碧云天），RIPA裂解液（索萊寶），蛋白Marker（全式金），ECL超敏發(fā)光液（索萊寶），Loading Buffer（全式金）．

1.1.4 儀器與設備

超凈工作臺（Thermo Fisher Scientific），高壓滅菌鍋（Shenan），分析天平（Mettler Toledo），電子天平（Shimadzu），高通量組織研磨儀（新芝），離心機（Thermo Fisher Scientific），PCR儀（Thermo Fisher Scientific），生化培養(yǎng)器（新苗），倒置顯微鏡（Olympus），紫外分光光度計（Synergy Biotek），石蠟切片機（Leica），電熱恒溫鼓干燥箱（Blue Pard），電泳裝置（Bio-Rad），轉膜裝置（Bio-Rad），凝膠成像儀（Bio-Rad）．

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

凍存菌株復蘇、傳代三次后，接入MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，4℃下6 000 r / min離心20 min，棄去上清，收集菌體．

1.2.2 動物模型的建立

選取6 – 8周齡SPF級健康C57BL/6雄性小鼠，適應性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機分為3組：對照組（Pair-Fed，PF）、酒精組（Alcohol Fed，AF）、酒精 + LGG組（AF + LGG），每組10只．實驗期間小鼠正常飼喂．AF + LGG組小鼠每天給予LGG處理（灌胃1 × 109CFU / 只），PF組和AF組小鼠每天給予MRS培養(yǎng)基處理，連續(xù)4周．實驗期間每周記錄小鼠體重．各組小鼠禁食16 h后，實驗最后一天清晨，AF組和AF + LGG組小鼠采用50%（V/V）的酒精按6 g / Kg的劑量灌胃，建立小鼠急性肝損傷模型，PF組給予等熱量的麥芽糖糊精．酒精或麥芽糖糊精處理6小時后處死小鼠，收集小鼠血清、肝臟組織以備后期實驗使用．采血后迅速剖取肝臟，用冷生理鹽水洗凈，濾紙吸濕后稱取肝臟濕重，計算肝系數(shù)．肝系數(shù) =（肝臟質量 / 體總質量）×100%．

1.2.3 血液生化分析

小鼠外周血置4℃離心機中，3 000 r / min離心15 min，收集上層血清．分別參照試劑盒操作說明書，檢測各組小鼠外周血血清中ALT和ALT的含量．

1.2.4 肝臟甘油三脂檢測

稱取適量肝臟組織，置于NP40 / ddH2O混合液中，使用組織勻漿機研磨組織后，參照試劑盒操作說明書測定肝臟組織中甘油三脂的含量．

1.2.5 肝臟組織病理組織學分析

新鮮肝臟組織用福爾馬林溶液固定，經脫水透明、浸蠟包埋、切片后，對肝臟組織切片進行脫蠟、脫苯、復水和H&E染色．在光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學變化．

1.2.6 總RNA的提取及qRT-PCR的檢測

參照試劑盒操作說明書，采用Trizol法提取肝臟組織的總RNA，并利用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄成cDNA，最后對肝臟組織中脂質合成和分解相關基因的mRNA表達水平進行RT-PCR分析．

1.2.7 蛋白質免疫印跡分析

參照RIPA組織裂解液操作說明書，提取肝臟組織總蛋白后，參照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度．取30 μg蛋白樣品進行白質免疫印跡（Western Blot）分析，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)進行顯影成像，使用Image Lab 4.1 programs軟件進行特異性條帶定量分析．

1.2.8 統(tǒng)計學分析

各組數(shù)據(jù)均采用平均值 ± 標準誤差（mean ± SEM）表示，統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 7.00軟件分析，兩組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計分析采用獨立樣本t檢驗．*P< 0.05、**P< 0.01、***P< 0.001分別表示有統(tǒng)計學差異、統(tǒng)計學有顯著差異和統(tǒng)計學有極其顯著的差異．

2 結 果

2.1 LGG預處理緩解酒精引起的肝臟損傷

研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，酒精組小鼠肝系數(shù)有所升高；與酒精組相比，酒精 + LGG組小鼠肝系數(shù)有所降低，但是均沒有統(tǒng)計學意義（圖1A）．外周血中丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）的含量是評估肝臟損傷的重要指標，本研究為了探究LGG對小鼠急性酒精肝損傷的影響，對小鼠外周血中ALT和AST的含量進行了分析，結果如圖1B、圖1C所示．

從圖1中可以看出，與對照組相比，酒精組小鼠外周血中ALT、AST的含量顯著升高，LGG預處理可顯著降低酒精引起的小鼠外周血中ALT的升高，這說明LGG預處理可以顯著緩解酒精引起的肝臟損傷．

2.2 LGG預處理緩解酒精引起的肝臟脂質堆積

組織學研究顯示，飲酒會引起肝臟脂質的堆積．為了探究LGG預處理對小鼠肝臟脂質堆積的影響，我們通過觀察急性酒精肝臟損傷模型中小鼠的肝臟組織病理切片，發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠肝細胞內有大量脂滴浸潤，但是用LGG預處理后再給予小鼠急性酒精處理，小鼠的肝細胞內脂滴浸潤大幅度減少，幾乎恢復至對照組狀態(tài)（圖2A）．甘油三酯（TG）是人體內含量最多的脂質，為了量化圖2A中觀察到的小鼠肝臟脂質堆積情況，我們檢測了各組小鼠肝臟中TG的含量，如圖2B所示，可以看出，與對照組小鼠相比，酒精組小鼠肝臟組織中的TG含量顯著升高，LGG預處理可顯著降低酒精引起的小鼠肝臟組織中的TG含量的升高．

2.3 LGG預處理對肝臟脂肪合成的影響

FAS、SCD1和ACC1在肝臟脂質合成中扮演著重要的角色．以上研究表明，LGG預處理能夠緩解酒精引起的肝臟脂質堆積，為了確認LGG預處理對肝臟脂質代謝相關基因的表達情況，我們對各組小鼠肝臟中FAS、SCD1和ACC1的mRNA水平和蛋白水平進行了檢測．研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，酒精組小鼠肝臟中FAS、SCD1和ACC1的mRNA水平以及FAS和SCD1的蛋白水平均顯著升高；與酒精組相比，LGG預處理后，F(xiàn)AS和SCD1的mRNA水平以及FAS和SCD1的蛋白水平均顯著降低．結果表明，LGG能夠有效緩解酒精引起的肝臟脂肪合成（圖3）．

2.4 LGG預處理對肝臟脂肪酸β-氧化的影響

為了進一步驗證LGG預處理對肝臟脂肪酸β-氧化的影響，我們分析了各組小鼠肝臟組織中脂肪酸β-氧化的相關基因CPT1、PGC1α和PPARα的mRNA水平和蛋白水平，如圖4所示．可以看出，與對照組相比，酒精組小鼠肝臟中CPT1和PGC1α的mRNA水平以及CPT1的蛋白水平顯著降低；與酒精組相比，用LGG預處理后，小鼠肝臟中CPT1和PGC1α的mRNA水平以及CPT1的蛋白水平顯著升高，進一步表明，LGG能夠改善酒精引起的肝臟脂肪堆積狀況．

圖3 各組小鼠肝臟組織中FAS（A）、SCD1（B）和ACC1（C）的mRNA水平以及FAS（D）和SCD1（E）的蛋白水平

3 討 論

ALD是一種常見的肝損傷形式，近30年來，隨著國民經濟的發(fā)展，酒精消費呈現(xiàn)爆炸性增長，ALD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[5]．由于ALD患者缺乏預防和治療意識，ALD往往會演變?yōu)椴豢赡孓D的肝臟損傷，如肝硬化，甚至肝癌[6]．益生菌具有抗氧化、調節(jié)腸道菌群以及改善腸道屏障功能等作用[7]，近年來越來越多的研究表明，LGG可以用于預防和治療肝臟疾病[6-9]．同時，已有研究表明，LGG及其培養(yǎng)上清均能改善慢性酒精誘導的肝臟損傷狀況[10]，另外有研究指出，LGG培養(yǎng)上清預處理5天能夠緩解酒精引起的腸道通透性增加，改善肝臟損傷狀況[4]．本研究通過給予小鼠連續(xù)4周的LGG處理、然后酒精灌胃來模擬人們的日常生活習慣，對LGG在急性肝損傷中的保護作用進行了研究．

臨床中通常通過檢測ALT和AST等水平的變化來進行肝功能的評價．我們使用一次性灌胃的方法建立了小鼠急性肝損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，酒精處理后，沒有接受LGG預處理的小鼠外周血中ALT和AST的水平顯著升高，而接受了LGG預處理的小鼠外周血中ALT的含量增加不明顯，說明LGG對急性酒精肝損傷有預防保護作用．

圖4 各組小鼠肝臟組織中CPT1（A）、PGC-1α（B）和PPARα（C）的mRNA水平以及CPT1（D）、PGC-1α（E）和PPARα（F）的蛋白水平

急性酒精性肝損傷受多種因素影響，本研究發(fā)現(xiàn)LGG預處理可顯著降低急性酒精引起的肝臟TG含量的增加．肝臟主要通過以下幾個方面維持脂質代謝平衡：肝細胞甘油三脂的合成，肝細胞內脂肪酸的β-氧化，肝細胞攝取有力的脂肪酸以及通過極低密度脂蛋白的形式輸出甘油三酯．通過分析肝臟脂肪合成重要基因FAS、SCD1和ACC1以及脂肪酸β-氧化關鍵基因CPT1、PGC1α和PPARα的mRNA水平和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)LGG可以抑制肝臟脂肪合成基因的表達并促進脂肪酸β-氧化基因的表達．綜上，LGG是通過調節(jié)肝臟脂質代謝而對酒精性肝病實現(xiàn)預防保護作用的，這為LGG在預防和治療酒精性肝臟疾病方面的應用提供了理論依據(jù)．