董丹秀，潘若辰，張偉祿,?，楊麗珠

(1．溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江溫州 325035；2．溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325035)

蛋白質(zhì)是一類(lèi)生物有機(jī)大分子，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是構(gòu)成細(xì)胞的基本的物質(zhì)．蛋白質(zhì)在完成有機(jī)體內(nèi)的生化代謝和有機(jī)體多樣的生理功能中發(fā)揮著非常重要的作用．因此，蛋白質(zhì)的定量分析在臨床醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的研究中是非常重要的．目前，定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法主要有比色分析法[1-2]、熒光分析法[3-4]和共振光散射法[5]等．也有文獻(xiàn)報(bào)道利用蛋白質(zhì)與有機(jī)染料小分子、藥物小分子等相互作用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，但多采用光譜分析法[6-7]．電分析化學(xué)法具有操作簡(jiǎn)便、高靈敏度和高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)不會(huì)受到顏色的干擾，近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用．硫堇（Thionine, TH）是一種結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)，具有芳環(huán)π-π共軛體系，帶有正電荷的吩噻嗪類(lèi)陽(yáng)離子染料，因其具有紫外吸收和電化學(xué)活性，故可使用光譜及電化學(xué)方法進(jìn)行研究[8-10]．1991年，碳納米管由日本科學(xué)家飯島博士（Iijima S.）首次發(fā)現(xiàn)[11]．它是一種針狀的管形的碳單質(zhì)，具有穩(wěn)定晶體結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有導(dǎo)電性好、比表面積大及較高催化活性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在電化學(xué)傳感器方面受到頗多關(guān)注[12-15]．

本文利用硫堇通過(guò)π-π共軛作用修飾到多壁碳納米管電極上，制備成硫堇/多壁碳納米管修飾電極作為工作電極，利用硫堇與蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)建了一種簡(jiǎn)便的電化學(xué)定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法．該方法簡(jiǎn)單、有效，具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可用于檢測(cè)人血清樣品中蛋白質(zhì)含量．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀 器

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在電化學(xué)系統(tǒng)（上海辰華儀器有限公司, CHI660a）上進(jìn)行．三電極體系：多壁碳納米管（Multiwall Carbon Nanotubes, MWNTs）修飾玻碳電極（GCE）為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極．紫外-可見(jiàn)光譜圖在紫外-可見(jiàn)分光光度儀（Varian Cary 50）上測(cè)定．pH值在pH計(jì)（上?？茖W(xué)精密儀器有限公司, PHS-3C）中測(cè)定．

1.1.2 試 劑

牛血清白蛋白購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，溶菌酶（Lyso）購(gòu)自上海伯奧生物科技有限公司，人血清白蛋白（HSA）和硫堇購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，上述樣品配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，置于4℃的冰箱．羧基化的多壁碳納米管（直徑在40 - 60 nm之間，純度 > 95%）購(gòu)自深圳納米港高科技有限公司．二甲基甲酰胺（DMF）購(gòu)自上海第四試劑廠．緩沖溶液的配制：磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由一定量的0.2 mol/L NaH2PO4溶液和0.2 mol/L Na2HPO4溶液混合；NaAc-HAc緩沖溶液由一定量的0.2 mol/L NaAc溶液和0.2 mol/L HAc溶液混合；Britton-Robinson（B-R）緩沖液由0.04 mol/L H3PO4、0.04 mol/L HAc和 0.04 mol/L H3BO3溶液混合，再用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值．其它試劑均為分析純．實(shí)驗(yàn)用水為超純水，實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多壁碳納米管修飾電極（MWNTs/GCE）的制備

在高溫條件下，將多壁碳納米管在2.0 mol/L的硝酸中攪拌回流純化7 h，然后在濃鹽酸中超聲分散1 h，之后用超純水沖洗至中性[16]，放入60℃的烘箱干燥12 h后備用．將2.0 mg的多壁碳納米管加入到1.0 mL的DMF中，超聲3 h分散得到黑色多壁碳納米管-DMF分散液．玻碳電極在0.3 μm和0.05 μm氧化鋁粉末中拋光，再分別用丙酮、乙醇和超純水超聲清洗，置于空氣中干燥、冷卻，然后在電極表面滴涂10 μL的多壁碳納米管-DMF分散液，紅外燈烘干后制得多壁碳納米管修飾電極（MWNTs/GCE）．

1.2.2 硫堇修飾的多壁碳納米管電極（TH/MWNTs/GCE）的制備

將上述制得的MWNTs/GCE浸入到2 mg/mL硫堇溶液中反應(yīng)20 min，再取出用超純水清洗30 min，以除去硫堇在電極表面的物理吸附，室溫下晾干后制得硫堇修飾碳納米管電極（TH/MWNTs/GCE），將修飾電極浸泡在B-R的緩沖液中（pH = 5.0）待用．

1.2.3 電化學(xué)測(cè)定方法

TH/MWNTs/GCE在B-R緩沖溶液（pH = 5.0）中用連續(xù)循環(huán)伏安掃描法在-0.8 - 0.4 V（vs.Ag/AgCl）范圍內(nèi)掃描，形成穩(wěn)定的峰電流．磁力攪拌下加入一定量的BSA并反應(yīng)5 min，然后用循環(huán)伏安法（Cyclic Voltammetry, CV）或線(xiàn)性?huà)呙璺卜ǎ↙inear Sweep Voltammetry, LSV）測(cè)定硫堇的氧化還原峰峰電流的變化．

1.2.4 交流阻抗法（EIS）

在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的溶液（含0.1mmol/L KCl）中記錄交流阻抗譜圖．正常電位下，頻率：10 Hz - 100 kHz，電壓振幅：1 mV．

1.2.5 紫外-可見(jiàn)分光光度法

配制5組待測(cè)溶液：0.4 mg/mL BSA，0.06 mg/mL硫堇，0.06 mg/mL硫堇 + 0.4 mg/mL BSA混合液、0.06 mg/mL硫堇 + 0.8 mg/mL BSA混合液和0.06 mg/mL硫堇 + 1.2 mg/mL BSA．記錄200 - 800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外-可見(jiàn)分光光譜圖．

2 結(jié)果和討論

2.1 BSA在TH/MWNTs/GCE上的電化學(xué)行為

圖1是當(dāng)掃描速度為0.1 V·s-1時(shí)、不同類(lèi)型的電極在B-R緩沖液（pH = 5.0）中的循環(huán)伏安（CV）曲線(xiàn)．圖1中曲線(xiàn)a為裸玻碳電極（GCE）的CV曲線(xiàn)．曲線(xiàn)b為多壁碳納米管修飾玻碳電極的CV曲線(xiàn)，可以看出背景信號(hào)明顯增大，這是由于多壁碳納米管修飾后電極的導(dǎo)電能力增大的結(jié)果．當(dāng)多壁碳納米管修飾玻碳電極在2.0 mg/mL濃度的硫堇溶液中反應(yīng)20 min，得到了硫堇修飾的多壁碳納米管電極（曲線(xiàn)c），可以在-0.08 V和-0.15V觀察到一對(duì)很明顯的硫堇的氧化還原峰，這是因?yàn)榱蜉婪肿又械姆枷悱h(huán)可以通過(guò)π-π共軛作用吸附到多壁碳納米管上．當(dāng)溶液中加入0.04 mg/mL BSA后，硫堇的氧化還原峰峰電流明顯下降，而峰電位基本保持不變（曲線(xiàn)d），當(dāng)加入更多量0.08 mg/mL的BSA時(shí)，硫堇的氧化還原峰峰電流下降更加明顯，這可能是由于BSA和硫堇之間形成了非電活性的化合物的緣故．

2.2 掃描速度的影響

通過(guò)循環(huán)伏安法對(duì)TH/MWNTs/GCE在掃描速度分別為0.025 V·s-1、0.05 V·s-1、0.075 V·s-1、0.1 V·s-1、0.12 V·s-1、0.15 V·s-1、0.2 V·s-1時(shí)進(jìn)行掃描，觀察其氧化還原峰電流，如圖2（a）．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硫堇的氧化還原峰的峰電流都隨著掃速的增加而相應(yīng)增大，且氧化還原峰的峰電流均與掃速呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程分別為ipa(μA) = 13.334 + 508.359V(V·s-1)（R= 0.995）和ipc(μA) =-12.340-502.151V(V·s-1)（R= 0.996），其中R為線(xiàn)性系數(shù)．說(shuō)明，TH/MWNTs/GCE電極表面的氧化和還原反應(yīng)是都是受吸附控制的．

上述溶液加入0.08 mg/mL的BSA得到的BSA/TH/MWNTs/GCE電極在0.025 - 0.2 V·s-1的掃速范圍內(nèi)掃描，檢測(cè)硫堇的氧化還原峰的峰電流變化，如圖2（b）．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同等的掃速條件下，氧化還原峰的峰電流均減小，并且氧化還原峰的峰電流與掃速之間呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為ipa(μA) = 4.058 + 269.588V(V·s-1)（R= 0.997）和ipc(μA) = -3.261-201.440V(V·s-1)（R= 0.999）．說(shuō)明BSA/TH/MWNTs/GCE電極表面的氧化和還原反應(yīng)均是是受表面吸附控制的．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在體系中加入BSA后，游離的硫堇濃度的降低，導(dǎo)致氧化還原峰電流的降低，進(jìn)一步說(shuō)明有非電活性物質(zhì)產(chǎn)生[17]．

圖2 TH/MWNTs/GCE在不同掃速條件下加入BSA前后的循環(huán)伏安曲線(xiàn)

2.3 紫外-可見(jiàn)光譜圖

通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了BSA和硫堇之間的結(jié)合作用，如圖3所示．BSA在278 nm處有一吸收峰，硫堇有三個(gè)吸收峰，分別在：235 nm，282 nm和600 nm．當(dāng)在硫堇溶液中加入了0.4 mg/mL BSA后，235 nm處的吸收峰消失，282 nm的吸收峰增強(qiáng)，且稍有藍(lán)移，600 nm處的吸收峰下降．當(dāng)繼續(xù)加入一定量的BSA（曲線(xiàn)d和e）后，282 nm的吸收峰增強(qiáng)，且稍有藍(lán)移，600 nm處的吸收峰繼續(xù)呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明硫堇和BSA發(fā)生結(jié)合．

圖3 硫堇和BSA作用的紫外分光光度圖

2.4 電化學(xué)交流阻抗圖（EIS）

根據(jù)電化學(xué)交流阻抗的變化來(lái)判斷電極表面的狀況．我們?cè)陔娀瘜W(xué)工作站上測(cè)定不同的電極修飾所得到的電極Nyquist圖譜（通過(guò)阻抗值的虛部Zim對(duì)其實(shí)部Zre作圖），轉(zhuǎn)移阻抗值（Ret）的數(shù)值等同于半圓的直徑，對(duì)應(yīng)的Nyquist圖譜是通過(guò)高頻區(qū)域的半圓連接到低頻區(qū)域的直線(xiàn)．根據(jù)文獻(xiàn)[18]可知，半圓反映電子轉(zhuǎn)移過(guò)程的特征，45度直線(xiàn)反映擴(kuò)散控制特征．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示．裸玻碳對(duì)應(yīng)曲線(xiàn)（曲線(xiàn)a）在高頻區(qū)域有較小直徑的圓?。s為30 Ω），這說(shuō)明裸玻碳電極（GCE）表面的反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的，裸玻碳電極阻擋Fe(CN)63-/4-的氧化還原反應(yīng)過(guò)程的電子傳輸較小．作為對(duì)比，MWNTs/GCE電極對(duì)應(yīng)的曲線(xiàn)（曲線(xiàn)b）在高頻區(qū)域的圓弧直徑接近于零，說(shuō)明了碳納米修飾電極能夠非常有效促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移．將碳納米管修飾電極浸入一定濃度的硫堇溶液反應(yīng)后，硫堇可以通過(guò)π-π共軛作用鍵合到修飾電極（MWNTs/GCE）表面，從而抑制了電子間的轉(zhuǎn)移（曲線(xiàn)c，高頻區(qū)域圓弧直徑為160 Ω）．在溶液中再加入0.08 mg/mL BSA后（曲線(xiàn)d），BSA/TH/MWNTs/GCE高頻區(qū)域圓弧直徑為240 Ω，由此可見(jiàn)電子轉(zhuǎn)移抑制明顯，表面BSA與硫堇相互作用后生成一種非電活性物質(zhì)，與之前實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致．

圖4 不同電極的交流阻抗圖圖譜

2.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.5.1 支持電解質(zhì)的選擇

我們對(duì)支持電解質(zhì)-緩沖溶液進(jìn)行了選擇．試驗(yàn)不同的緩沖溶液對(duì)硫堇的氧化還原峰的影響，包括0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH：4.5 - 7.0）；0.2 mol/L的NaAc-HAc緩沖溶液（pH：3.8 -5.4）和B-R緩沖溶液（pH：2.5 - 7.5）．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在B-R緩沖溶液中峰電流最大、峰形最好且可逆性最好，因此選擇B-R緩沖溶液作為支持電解質(zhì)．同時(shí)也試驗(yàn)了不同的pH值的B-R緩沖溶液對(duì)硫堇氧化還原峰的影響（圖5）．發(fā)現(xiàn)隨著酸性的增大，峰電位向正電位方向移動(dòng)，說(shuō)明有H+參與反應(yīng)的進(jìn)行．當(dāng)pH為5的時(shí)候，硫堇的氧化還原峰的峰形好且峰電流較大，選擇支持電解質(zhì)為pH為5的B-R緩沖溶液．

2.5.2 修飾劑用量的選擇

實(shí)驗(yàn)選擇不同量的碳納米管-DMF修飾劑（2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL）分別和2.0 mg/mL的硫堇溶液發(fā)生反應(yīng)，觀察其氧化還原峰電流的變化（圖6）．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)修飾劑的用量達(dá)到10 μL時(shí)，氧化還原峰已經(jīng)比較明顯且峰形較好，最終選擇修飾劑的用量為10 μL．

圖5 B-R緩沖溶液的pH值對(duì)BSA測(cè)定的影響

圖6 碳納米管-DMF修飾劑用量的影響

2.5.3 硫堇和碳納米管修飾電極間的反應(yīng)時(shí)間的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了多壁碳納米管修飾電極（MWNTs/GCE）和硫堇溶液（2.0 mg/mL）不同的反應(yīng)時(shí)間（分別為5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min），比較硫堇的氧化還原峰的峰電流大?。▓D7）．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在5 - 20 min的范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，硫堇的峰電流隨之增大．當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于20 min，硫堇的峰電流增加不明顯，說(shuō)明兩者反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到飽和．因此，選定20 min作為硫堇和多壁碳納米管修飾電極的反應(yīng)時(shí)間．

圖7 硫堇和碳納米管修飾電極間的反應(yīng)時(shí)間的影響

圖8 BSA和硫堇修飾碳納米管電極上硫堇的反應(yīng)時(shí)間的影響

2.5.4 BSA和硫堇修飾碳納米管電極上硫堇的反應(yīng)時(shí)間的選擇

將一定量的BSA（0.06 mg/mL）加到浸有硫堇修飾多壁碳納米電極的緩沖溶液里，靜置．實(shí)驗(yàn)了不同的反應(yīng)時(shí)間（分別為0.5 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min和8 min）的影響（圖8），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到達(dá)及超過(guò)5 min后，硫堇的氧化還原峰峰電流基本保持穩(wěn)定，因此選擇5 min作為反應(yīng)的時(shí)間．

2.6 BSA的線(xiàn)性、測(cè)定穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

采用LSV分別測(cè)定了硫堇修飾多壁碳納米管電極上的氧化還原峰與BSA的作用，如圖9所示．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)SA濃度增加，硫堇氧化還原峰的峰電流相應(yīng)下降，這是因?yàn)锽SA濃度的增加，導(dǎo)致更多的非電活性物質(zhì)產(chǎn)生．硫堇的氧化還原峰的峰電流的下降值和加入的BSA濃度在0.01 - 0.12 mg/mL范圍之間呈線(xiàn)性關(guān)系，如圖9所示．氧化峰的線(xiàn)性方程為Δipa(μA) = 3.401 +336.775cBSA(mg/mL)（R= 0.997），還原峰的線(xiàn)性方程為Δipc(μA) = -4.252 - 415.045cBSA(mg/mL)（R= 0.997），最低檢測(cè)限達(dá)到0.004 mg/mL．

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了該體系對(duì)溶菌酶（Lyso）和人血清白蛋白（HSA）的氧化還原響應(yīng)，以氧化峰為例，得到相應(yīng)的工作曲線(xiàn)，分別為Δipa(μA) = 5.678 + 405.235cHSA(mg/mL)（HSA的濃度在0.008 -0.08 mg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R= 0.998），Δipa(μA) = 10.578 + 289.345cLyso(mg/mL)（Lyso的濃度在0.01 - 0.20 mg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R= 0.995）．由于本方法對(duì)不同類(lèi)別的蛋白均有響應(yīng)，因此可用于測(cè)定血清樣品中的總蛋白含量．目前熒光光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量[4-5,19-20]發(fā)展非常迅速，但該方法不僅耗時(shí)，還需比較昂貴的樣品和儀器設(shè)備．極譜分析測(cè)定蛋白質(zhì)[21-22]的靈敏度較高，但缺點(diǎn)是毒性較大．我們?cè)O(shè)計(jì)的電化學(xué)方法測(cè)定蛋白質(zhì)具有快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，方法對(duì)于一些在短時(shí)需要結(jié)果的實(shí)驗(yàn)是非常有利的．

圖9 不同濃度BSA和硫堇相互作用的線(xiàn)性?huà)呙璺睬€(xiàn)

對(duì)同一支TH/MWNTs/GCE電極，加入0.08 mg/mL BSA前后進(jìn)行連續(xù)的10次測(cè)定，評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入BSA前后的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation, RSD）分別是2.2%和2.4%，顯示本實(shí)驗(yàn)具有很好的重現(xiàn)性．另外，我們用相同方法修飾10支TH/MWNTs/GCE電極，考察不同修飾電極間的重現(xiàn)性．結(jié)果顯示，相同方法修飾的10支不同的電極（TH/MWNTs/GCE）的RSD為4.3%，說(shuō)明制備TH/MWNTs/GCE的方法有實(shí)用的價(jià)值．

2.7 干擾物質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)了一些氨基酸（包括L-白氨酸，D/L-酪氨酸，絲氨酸，酪氨酸，L-胱氨酸）和實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的物質(zhì)（包括蘋(píng)果酸，葡萄糖、檸檬酸）和一些金屬離子（包括K+、Ca2+、Zn2+、Na+）等對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果見(jiàn)表1．

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)相對(duì)誤差在10%以?xún)?nèi)時(shí)，低濃度的上述物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響不大．相同濃度的D/L-酪氨酸、絲氨酸、L-胱氨酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、Ca2+、Zn2+、Na+、K+不影響測(cè)定，相同濃度的L-白氨酸和葡萄糖稍有影響．然而，在實(shí)際的樣品測(cè)定過(guò)程中，血清樣品常稀釋1 000倍以上，因此以上物質(zhì)在測(cè)定溶液中的濃度很小，基本可以不考慮干擾的問(wèn)題．

2.8 人血清樣品中蛋白質(zhì)的分析

移取0.1 mL人血清樣品（4個(gè)不同的血清樣品，由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的檢驗(yàn)科提供），用超純水配置成100 mL溶液，置于容量瓶中，置于4℃冰箱中備用．按照擬定方法測(cè)定1.0 mL的樣品，并做回收率實(shí)驗(yàn)．回收率在97.9% - 103.2%之間，5次測(cè)定的RSD在2.0% - 3.0%之間，結(jié)果見(jiàn)表2．與經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)法（CBB G2250）[23]結(jié)果一致．

表1 干擾物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果（n = 3）

表2 樣品的分析結(jié)果和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n = 5）

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了一種基于硫堇修飾多壁碳納米管電極上硫堇與蛋白質(zhì)的相互作用的電化學(xué)檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法．運(yùn)用電化學(xué)方法（循環(huán)伏安法和線(xiàn)性?huà)呙璺卜ǎ┖妥贤?可見(jiàn)光譜法來(lái)研究硫堇修飾的碳納米管電極上硫堇與BSA的相互作用，實(shí)驗(yàn)表明BSA可以和硫堇修飾碳納米管電極上的硫堇之間生成了一種非電活性化合物．在實(shí)驗(yàn)選定的最佳測(cè)量條件下，硫堇的氧化還原峰峰電流的下降值和BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系．方法簡(jiǎn)單、有效，具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可用于檢測(cè)人血清樣品中蛋白質(zhì)含量．