鄭俊鳴,陳思凱,陳禮光,洪小龍，何天友,鄭郁善

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建省東山赤山國有防護(hù)林場，福建 漳州 363400)

福建濱海沙地防護(hù)林以木麻黃、濕地松等為主，其退化快，生產(chǎn)力弱，結(jié)構(gòu)單一，影響了生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性.大頭典竹(Bambusabeecheyanavar.pubescens)根系發(fā)達(dá)，適生性強(qiáng)，竹材纖維長，抗風(fēng)性相對較強(qiáng)，具有極強(qiáng)的濱海沙地防護(hù)林應(yīng)用的潛力.2002年引種大頭典竹至福建東山島濱海沙地，其成活率較高、生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，且能有效改良土壤環(huán)境、林分結(jié)構(gòu)，定植成功后能有效提高其他生物的引種成活率，如水黃皮、潺槁木姜子等，產(chǎn)生了極大的生態(tài)效益[1].濱海沙地的土壤鹽分或鹽煞對植物生長造成較大的影響，根系或葉片細(xì)胞滲透壓改變，導(dǎo)致植物失水或死亡[2].目前，關(guān)于竹類對鹽脅迫的響應(yīng)主要集中在生理、生化方面[3-4].在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究相對較少[5].蛋白質(zhì)組學(xué)是通過蛋白質(zhì)表達(dá)水平來解釋生命活動(dòng)現(xiàn)象.不同植物在鹽脅迫下的蛋白響應(yīng)不同，黑麥草、燕麥和草地早熟禾等抗氧化酶以及水稻根中的抗病蛋白、β-1-3葡聚糖酶等在鹽脅迫下出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[6-7]，可能與抗鹽性有關(guān)[8-9].葉片是植物進(jìn)行光合作用和呼吸作用的營養(yǎng)器官，是進(jìn)行二氧化碳固定和碳同化的主要場所，能較快地反映鹽脅迫對植物的影響.本文通過分析與鑒定不同NaCl溶液脅迫下大頭典竹葉片的蛋白表達(dá)量，進(jìn)一步揭示大頭典竹的蛋白功能和代謝通路對鹽脅迫的適應(yīng)情況，為培育適宜濱海沙地生長的耐鹽品種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來源于福建省漳州市東山島濱海沙地，選取長勢良好、均勻一致的2年生側(cè)枝扦插到福州市福建農(nóng)林大學(xué)的盆缽中，待側(cè)枝萌發(fā)長出新葉，以供試驗(yàn)需要.試驗(yàn)前測得樣地鹽分為0.6%.因此，試驗(yàn)分別用0% (CK)、0.4%、0.6% NaCl溶液處理(用1/2 Hoagland營養(yǎng)液配制).處理7 d后，對大頭典竹進(jìn)行取樣，選取長勢一致的葉片作為試驗(yàn)材料，液氮保存，并提取竹葉蛋白，放入冰箱內(nèi)-80 ℃保存.樣品的制備和2-DE試驗(yàn)均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)以確保試驗(yàn)的精確性和重復(fù)性.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 全蛋白提取 葉全蛋白提取方法參考陳思凱等[10].稱取0.2 g葉片加入2 mL離心管內(nèi)，加入少量聚乙烯吡咯烷酮.液氮冷卻后研磨至粉末，移至離心管，再加入液氮進(jìn)行冷卻，加滿10% TCA/丙酮溶液后進(jìn)行渦旋振蕩.在4 ℃，17 000×g離心10 min，去除上清液.用80%甲醇、0.1 mol·L-1醋酸銨溶液和80%丙酮溶液進(jìn)行清洗.風(fēng)干30 min后，加入SDS提取液和Tris飽和酚，渦旋振蕩，17 000×g離心，提取上層酚相后加滿甲醇醋酸銨溶液，待沉淀后離心，去除上清液，并干燥.依次加入80%丙酮溶液、100%甲醇溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩和離心.重復(fù)3～4次至洗凈，風(fēng)干30 min，獲取蛋白干樣.

1.2.2 蛋白裂解和定量 稱取10 mg葉蛋白干粉，加入500 μL裂解液，渦旋振蕩10 min，超聲5 min，冰浴5 min.在4 ℃，17 000×g離心10 min，提取上清液，即純凈蛋白.運(yùn)用Brafford法[11]對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，選擇牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn).

1.2.3 雙向電泳分析 采用BIO-RAD公司的17 cm的pH 5～8 IPG膠條，具體操作步驟參考陳思凱[10].

1.2.4 差異蛋白的質(zhì)譜分析 顯色的膠片用UMAX Power Look 2100XL掃描儀采集圖像.凝膠圖像分析在PDQURST 8.0中完成.差異蛋白點(diǎn)運(yùn)用MALDI-TOF-MS 5800質(zhì)譜分析儀進(jìn)行蛋白鑒定.差異蛋白表達(dá)量以對照組的凝膠為參考膠，分別與0.4%、0.6% NaCl處理的凝膠進(jìn)行兩兩對比，篩選差異蛋白在蛋白表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)差異大于1.5倍，并通過t檢驗(yàn)有顯著差異(P<0.05)的蛋白[12].

1.2.5 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用Blast2GO軟件(https://www.blast2go.com/)對差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋[13].通過基因本體數(shù)據(jù)庫計(jì)算GO分類的差異蛋白數(shù)量，按照生物過程、分子功能和細(xì)胞組分對已鑒定的差異蛋白進(jìn)行比較分析[14].利用在線分析工具KAAS(https://www.genome.jp/tools/kaas/)對差異蛋白進(jìn)行KEGG代謝通路注釋.通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)，找到匹配度最高的蛋白質(zhì)，進(jìn)行KO歸類，繼而獲取蛋白序列參與的通路信息[15].

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì).運(yùn)用ImageMaster 2D Platinum 7.0進(jìn)行雙向凝膠譜圖分析.運(yùn)用Photoshop CS 5.0進(jìn)行作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度處理下葉片差異蛋白的表達(dá)情況

0.4%和0.6%NaCl溶液處理的竹葉蛋白的清晰凝膠圖譜，每個(gè)處理得到蛋白點(diǎn)約600個(gè)(圖1).不同含量NaCl溶液處理檢測的差異蛋白數(shù)量不同.經(jīng)PDQuest 8.0檢測，在0.4% NaCl處理下，34個(gè)差異蛋白表達(dá)量差異顯著，其中12個(gè)差異蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，22個(gè)差異蛋白表達(dá)量顯著下調(diào).在0.6% NaCl處理下有40個(gè)表達(dá)量差異顯著的蛋白，其中有27個(gè)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，13個(gè)蛋白表達(dá)量顯著上調(diào).

圖中數(shù)字表示成功鑒定的蛋白樣品編號(hào).圖1 雙向電泳分析不同NaCl溶液處理大頭典竹葉片蛋白表達(dá)圖譜Fig.1 Protein expression maps under different concentrations of NaCl by 2-DE analysis

從差異蛋白中挑選出18個(gè)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，成功鑒定了15個(gè)差異蛋白(圖1，表1).15個(gè)成功鑒定的差異蛋白分別涉及光合作用、能量代謝、碳代謝和細(xì)胞防御等相關(guān)蛋白.涉及的光合作用相關(guān)蛋白有3個(gè)，分別為葉綠體PsbP(2個(gè))和放氧增強(qiáng)子蛋白1(1個(gè))；能量代謝相關(guān)蛋白有4個(gè)，分別為ATP合酶α亞基(1個(gè))、ATP合酶β亞基(2個(gè))和磷酸甘油酸激酶(1個(gè))；碳代謝相關(guān)蛋白有5個(gè)，分別為核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(5個(gè))；細(xì)胞防御蛋白相關(guān)蛋白有2個(gè)，分別為谷氨酰胺合成酶(1個(gè))和抗壞血酸過氧化物酶(1個(gè))；其他和未知蛋白有1個(gè).其中，涉及碳代謝相關(guān)蛋白所占比例最大，達(dá)到33.33%，其次為能量代謝、光合作用相關(guān)蛋白，所占比例分別為26.67%和20.00%.由此說明，鹽脅迫主要影響碳代謝、能量代謝和光合作用相關(guān)蛋白，從而影響植物的正常生命活動(dòng).

表1 鹽脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果1)Table 1 Protein spectrum under salt stress

在0.4%和0.6% NaCl處理時(shí)，葉綠體PsbP、放氧增強(qiáng)子蛋白1、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、抗壞血酸過氧化物酶2、磷酸甘油酸激酶的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào).而ATP合酶β亞基蛋白表達(dá)量在0.4%和0.6% NaCl處理時(shí)顯著下調(diào).ATP合酶α亞基表達(dá)量在0.4% NaCl處理后呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，在0.6% NaCl處理后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢.

2.2 差異蛋白GO注釋和KEGG通路分析

15個(gè)成功鑒定的差異蛋白GO功能注釋，涉及生物過程、分子功能和細(xì)胞組分等3個(gè)方面(表2).生物過程涉及細(xì)胞過程、代謝過程、刺激反應(yīng)、定位過程等，蛋白數(shù)量分別為11、6、1、1個(gè).分子功能可分為離子結(jié)合功能、轉(zhuǎn)運(yùn)活性功能、催化活性功能，蛋白數(shù)量分別為9、3、10個(gè).細(xì)胞組分包含有細(xì)胞、細(xì)胞部件、細(xì)胞膜、細(xì)胞器，蛋白數(shù)量分別為10、10、4、9個(gè).

在GO注釋的基礎(chǔ)上，對差異蛋白參與的代謝通路進(jìn)行分析.15個(gè)差異蛋白的代謝通路參與了光合作用代謝通路、氧化磷酸化代謝通路、碳代謝作用、乙醛酸和二羧酸代謝等10條代謝通路(表3).1種差異蛋白可能參與多條代謝通路.其中，碳代謝作用、乙醛酸和二羧酸代謝、光合作用和氧化磷酸化涉及的蛋白數(shù)量相對較多，說明鹽脅迫對大頭典竹生長的影響主要在這些代謝途徑.

表2 鹽脅迫下大頭典竹葉片差異蛋白的GO功能分類Table 2 GO functional classification of differential proteins under different concentrations of NaCl

表3 鹽脅迫下大頭典竹葉片差異蛋白 的KEGG代謝通路分析Table 3 KEGG pathway analysis of differential proteins under different concentrations of NaCl

3 鹽脅迫相關(guān)蛋白功能及代謝通路分析

3.1 大頭典竹響應(yīng)鹽脅迫中光合作用相關(guān)蛋白

3個(gè)與光合作用相關(guān)的蛋白在0.4%、0.6% NaCl脅迫下蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為2個(gè)葉綠體PsbP和1個(gè)放氧增強(qiáng)子蛋白1(表1).葉綠體PsbP(又稱放氧增強(qiáng)子蛋白2)和放氧增強(qiáng)子蛋白1位于PSⅡ內(nèi)部，而PSⅡ是植物光合作用光反應(yīng)的重要成員[16-18].PSⅡ結(jié)構(gòu)中的放氧機(jī)構(gòu)易受到環(huán)境脅迫的影響[19].因此，葉綠體PsbP和放氧增強(qiáng)子蛋白1在鹽脅迫下，放氧反應(yīng)會(huì)遭受抑制，光合速率降低，造成植物光合作用的代謝通路受到影響(表3).

鹽脅迫使得放氧增強(qiáng)子蛋白1遭到破壞，釋放大量的氧氣以保持PSⅡ的穩(wěn)定和機(jī)體的代謝水平[20].植物的放氧增強(qiáng)子蛋白1表達(dá)量顯著上調(diào)以適應(yīng)鹽脅迫.葉綠體PsbP蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，有利于PSⅡ的穩(wěn)定，維持光合速率，進(jìn)而抵御鹽脅迫對植物生命活動(dòng)的傷害[18].由此，鹽脅迫下植物葉綠體PsbP和放氧增強(qiáng)子蛋白1顯著上調(diào).

3.2 大頭典竹響應(yīng)鹽脅迫中能量代謝相關(guān)蛋白

15個(gè)差異蛋白中有4個(gè)蛋白涉及能量代謝，分別為1個(gè)ATP合酶α亞基、2個(gè)ATP合酶β亞基和1個(gè)磷酸甘油酸激酶.磷酸甘油酸激酶主要參與糖酵解途徑，生成ATP，而糖酵解途徑是植物體內(nèi)能量代謝和碳代謝的主要途徑，也是植物對鹽脅迫的適應(yīng)性策略之一.應(yīng)對脅迫的響應(yīng)，香蕉和鹽芥的磷酸甘油酸激酶表達(dá)豐度均呈現(xiàn)上調(diào)[18,21].受到鹽脅迫的大頭典竹需要更多的ATP提供能量，所以，磷酸甘油酸激酶蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了顯著上調(diào)，以維持生命活動(dòng).

ATP合成酶α亞基和β亞基分布在線粒體內(nèi)膜和葉綠體類囊體上，完成ADP和ATP的轉(zhuǎn)化，是生物體能量代謝的關(guān)鍵[22].大頭典竹在0.4%和0.6% NaCl脅迫下，ATP合酶β亞基呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢.鹽脅迫導(dǎo)致植物ATP合成受到抑制，ATP合酶降解，從而ATP合酶β亞基蛋白表達(dá)量下調(diào).ATP合酶α亞基的蛋白表達(dá)量在0.4% NaCl處理后顯著上調(diào)，在0.6% NaCl處理后下調(diào).大頭典竹通過調(diào)節(jié)ATP合酶亞基的表達(dá)能力，以緩解蛋白表達(dá)量下調(diào)對植物生長發(fā)育造成的影響，從而適應(yīng)鹽脅迫[18].

3.3 大頭典竹響應(yīng)鹽脅迫中碳代謝相關(guān)蛋白

差異蛋白中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶是碳代謝途徑中重要的羧化酶，參與了碳固定、三羧酸代謝等代謝通路；同時(shí)，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶又是植物中含量最高的蛋白質(zhì)，具有催化羧化的功能，也能起到催化氧化的作用[23].羧化酶活性對植物光合速率有顯著影響[24].在0.4%和0.6% NaCl處理后核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，通過加強(qiáng)碳代謝活動(dòng)，提高植物的光合速率為植物應(yīng)對逆境脅迫提供更多的能量.

3.4 大頭典竹響應(yīng)鹽脅迫中防御型相關(guān)蛋白

葉片在干旱處理后，抗氧性相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)[22]，以提高植物對逆境的適應(yīng)能力.在0.4%和0.6%NaCl處理后，2個(gè)防御型相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為谷氨酰胺合成酶和抗壞血酸過氧化物酶2.其中，谷氨酰胺合成酶起到細(xì)胞防御作用[25].谷氨酰胺合成酶的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，可能是通過增強(qiáng)氮同化以維持植物正常生理代謝.抗壞血酸過氧化物酶2起抗氧化作用，能減緩活性氧對植物的傷害[26].清除類囊體邊緣產(chǎn)生的H2O2，穩(wěn)定光合機(jī)構(gòu)[27].大頭典竹在0.4%和0.6% NaCl脅迫下，壞血酸過氧化物酶2的蛋白表達(dá)量升高，以維持正常的生理代謝，增強(qiáng)自由基清除系統(tǒng)功能，提高植物對鹽的忍耐度.

3.5 代謝通路

GO功能分析顯示，鹽脅迫使大頭典竹生命活動(dòng)的細(xì)胞過程和代謝過程受到較大影響.鹽脅迫的危害主要為離子毒害、滲透脅迫等[28].大頭典竹通過滲透調(diào)節(jié)，維持離子平衡，緩解滲透脅迫，因此離子結(jié)合功能及催化活性功能的差異蛋白表達(dá)顯著，通過離子結(jié)合以降低離子對生長的脅迫，并通過催化活性提高代謝速率來抵御鹽脅迫.植物處于逆境脅迫時(shí)，會(huì)在分子、細(xì)胞及生理水平上產(chǎn)生自我調(diào)節(jié)，從而適應(yīng)逆境[29].KEGG代謝通路分析結(jié)果表明，大頭典竹在受到鹽脅迫時(shí)，光合作用、碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝等代謝途徑受到顯著影響[30].蛋白質(zhì)之間通過相互作用，直接或間接參與各種代謝通路，從而實(shí)現(xiàn)相互調(diào)節(jié)的目的[31].因此，鹽脅迫對植物代謝通路的影響多達(dá)10條.乙醛酸和二羧酸代謝為機(jī)體提供能量，促進(jìn)植物生長發(fā)育.香蕉、甜高粱等植物受到鹽脅迫時(shí)，光合作用途徑、碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝等途徑也受到顯著的影響[18,31]，從而影響植物的生長發(fā)育.

4 結(jié)論

大頭典竹在0.4%和0.6% NaCl脅迫下，共鑒定出15個(gè)差異顯著的蛋白.15個(gè)差異蛋白涉及生物過程、分子功能和細(xì)胞組分等方面，KEGG代謝通路參與了10條，以碳代謝作用、乙醛酸和二羧酸代謝為主.0.4%和0.6% NaCl溶液處理的葉綠體PsbP、放氧增強(qiáng)子蛋白1、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、谷氨酰胺合成酶、抗壞血酸過氧化物酶2、磷酸甘油酸激酶的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，ATP合酶β亞基蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，而ATP合酶α亞基表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢.差異蛋白對鹽脅迫的響應(yīng)反映了植物在蛋白功能表達(dá)和代謝途徑上對逆境的協(xié)調(diào)和自適應(yīng)，為進(jìn)一步探索大頭典竹的耐鹽機(jī)理提供基礎(chǔ).