潘曉鴻,洪纖纖,方 云,饒文華,陳芳容,聶丹玥,郭雪萍,張頂洋,關(guān) 雄

(福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室/生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種廣泛分布于自然環(huán)境中的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，具有形成快、營養(yǎng)簡單的特點.其菌制劑由于容易生產(chǎn)、保存時間較長且田間使用方便，已成為應(yīng)用最為廣泛的生物農(nóng)藥之一[1]，主要用于防治大多數(shù)絲狀真菌引起的田間病害，如棉花枯萎病、荔枝霜疫病等[2].生物膜是指細(xì)菌通過分泌多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以連結(jié)細(xì)菌群體而形成的具有黏附性有組織的膜狀結(jié)構(gòu)[3-6].生物膜能將細(xì)胞與細(xì)胞緊密連結(jié)起來，提高彼此之間的基因轉(zhuǎn)移與交換頻率，從而增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)能力，增加種群多樣性[7]，最終使其發(fā)揮正常的生防和促生作用.枯草芽孢桿菌在農(nóng)田中通常以生物膜形式定殖于植物根系[8]，這種特征可以保護(hù)植物根系免受其他病原物侵害，使根系上的細(xì)胞群體數(shù)量保持在較高水平，從而分泌較高濃度的抗生素和胞外酶；同時有利于細(xì)菌自身抵御外界不良環(huán)境，保持其生防能力.枯草芽孢桿菌生物膜形成能力越強(qiáng)，防治植物病害效果越顯著[1].因此，研究生物膜的形成能力及形成條件將有助于今后生防細(xì)菌的遺傳改良研究及合理使用.

當(dāng)前學(xué)者們主要針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[9]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[10]、單增李斯特菌(Listeriamonocytogene)[11]的生物膜進(jìn)行了研究，而有關(guān)產(chǎn)孢菌類生物膜的研究較少，枯草芽孢桿菌生物膜形成條件的優(yōu)化研究則更少.李南薇等[12]利用平板菌落計數(shù)法針對蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)生物膜培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)基濃度、碳源、無機(jī)鹽5個因素進(jìn)行了優(yōu)化；吳園園等[13]采用比濁法對枯草芽孢桿菌NCD-2生物膜培養(yǎng)基種類、溫度、金屬離子進(jìn)行了優(yōu)化；馬悅等[14]結(jié)合上述兩種方法探究了蠟樣芽孢桿菌生物膜的形成條件.本研究以結(jié)晶紫染色法和烘干稱重法相結(jié)合對枯草芽孢桿菌液體生物膜形成能力進(jìn)行評估，同時對其培養(yǎng)基成分[葡萄糖、鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)濃度]和培養(yǎng)環(huán)境(pH值、溫度)進(jìn)行篩選，并通過L16(45)正交試驗進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步合理利用枯草芽孢桿菌生物膜和研究該菌的生防機(jī)理奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌菌株BS-2，由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室保存.液體LB培養(yǎng)基：1%氯化鈉，1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，調(diào)節(jié)pH值為7.2，高壓滅菌.固定LB培養(yǎng)基：稱取2.5 g瓊脂粉緩慢倒入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，高壓滅菌.

1.1.2 試劑 Mg2+、Ca2+母液：稱量適量的氯化鎂、氯化鈣，在水溶液中配制成濃度分別為 0.01、0.1、1、10、20、30 mmol·L-1的母液，高壓滅菌.

葡萄糖母液：稱取適量的葡萄糖，在水溶液中配制濃度為2、4、6、8、10、12 g·L-1的葡萄糖溶液，用超濾膜過濾.

1.2 生物膜形成能力的評估方法

1.2.1 菌液的制備 將-80 ℃保藏的BS-2菌株按1%接種到1.5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1隔夜培養(yǎng)后，將該菌液均勻地涂于平板活化，一段時間后挑取單菌落于試管LB中.待試管內(nèi)溶液變渾濁，將菌液再次轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，使菌液D600 nm≈2.8(約10 h)[15]，用于后續(xù)試驗.

1.2.2 96孔板染色法 按1%轉(zhuǎn)接量將菌液接種到具有不同培養(yǎng)條件的LB液體培養(yǎng)基中，逐一分裝入96孔板，每孔為180 μL，重復(fù)3次.培養(yǎng)結(jié)束后慢慢拿出平板，在每孔內(nèi)加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色，將菌液充分甩干后輕柔地沖洗3次，再加入200 μL 95%乙醇，靜置若干分鐘后混勻[13].使用酶標(biāo)儀測定其D595 nm值，以此判斷生物膜的形成能力.

1.2.3 觀察法 按1%轉(zhuǎn)接量將菌液接種到裝有新鮮LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，每個處理設(shè)置3個重復(fù).靜置培養(yǎng)1 d后，觀察錐形瓶內(nèi)生物膜形成厚度，拍照記錄.

1.2.4 烘干稱重法 標(biāo)記并稱量錐形瓶凈重，在不同試驗條件下培養(yǎng)生物膜后，使用移液槍除去培養(yǎng)基，保留生物膜，并放入64 ℃干燥烘箱中烘干24 h，稱量含有生物膜干物質(zhì)的錐形瓶質(zhì)量并計算前后之差，每個處理設(shè)置3個重復(fù).根據(jù)生物膜烘干質(zhì)量絕對值大小，確定最佳的培養(yǎng)條件.

1.3 影響生物膜形成的單因素試驗

將培養(yǎng)溫度分別調(diào)節(jié)為25、30、35、40、45 ℃，比較溫度對生物膜形成的影響.用pH計調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，比較pH值對生物膜形成的影響.將培養(yǎng)基中Mg2+和Ca2+濃度分別調(diào)節(jié)為0.01、0.1、1、10、20 mmol·L-1，比較Mg2+和Ca2+濃度對生物膜形成的影響[13].在LB液體培養(yǎng)基中分別加入除菌過濾后的葡萄糖溶液，使其濃度為2、4、6、8、10、12 g·L-1，比較葡萄糖濃度對生物膜形成的影響.

1.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，設(shè)計葡萄糖濃度(A)、Mg2+濃度(B)、Ca2+濃度(C)、初始pH值(D)、溫度(E)5個影響因素的L16(45)正交試驗(表1)，同時以純LB培養(yǎng)基作為空白對照.按照1%轉(zhuǎn)接量接種菌液，記錄LB培養(yǎng)基中生物膜的干重.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計，使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，使用Origin 8.0軟件作圖.

表1 影響枯草芽孢桿菌生物膜形成的5個因素的水平設(shè)計Table 1 Levels of 5 factors affecting the formation of B.subtilis biofilm

2 結(jié)果與分析

2.1 生物膜形成能力的評估方法

從圖1A可以看出，生物膜成熟后細(xì)胞聚集在一起且被胞外大分子團(tuán)團(tuán)包圍在內(nèi)部.當(dāng)用結(jié)晶紫染色后，染色劑無法進(jìn)入生物膜內(nèi)部，造成染色不充分(圖1B).試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，新形成的尤其是氣液界面的生物膜較為疏松，若漂洗太過用力將造成生物膜破壞、脫落、丟失，若漂洗不徹底又不容易洗去雜質(zhì)，進(jìn)而影響試驗結(jié)果.因此，進(jìn)一步采用烘干稱重法定量評估生物膜形成能力.由圖1C-E可見，去掉培養(yǎng)基后生物膜仍保留完整，說明生物膜烘干稱重法可行.

A.生物膜于96孔板中培養(yǎng);B.生物膜被結(jié)晶紫染色;C.氣液界面的生物膜;D.生物膜烘干前;E.生物膜烘干后.圖1 枯草芽孢桿菌生物膜形態(tài)Fig.1 The morphology of B.subtilis biofilm

2.2 影響生物膜形成的單因素試驗結(jié)果

將菌液按1%轉(zhuǎn)接量接種至高壓滅菌的LB培養(yǎng)基中，探究不同溫度下枯草芽孢桿菌生物膜的形成量.結(jié)果表明：過低(<30 ℃)或過高(>40 ℃)溫度都不利于生物膜形成；35 ℃為生物膜形成的最適溫度，該溫度下生物膜的干重接近于45 ℃時的2倍(圖2A).

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，經(jīng)過高壓滅菌后接種菌液，并放入35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1 d.結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌生物膜形成能力隨著pH值升高而降低，初始pH=5.0時，生物膜干重最大(圖2B).

將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為5.0，高壓滅菌后接種菌液，并分別向培養(yǎng)基中添加0.01、0.1、1、10、20、30 mmol·L-1Mg2+溶液，35 ℃下靜置培養(yǎng)1 d.結(jié)果表明，Mg2+濃度在1～20 mmol·L-1時，對枯草芽孢桿菌生物膜起促進(jìn)作用，濃度高于20 mmol·L-1時會抑制生物膜形成.當(dāng)Mg2+濃度為20 mmol·L-1時，生物膜干重最大(圖2C).

將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為5.0，高壓滅菌后接種菌液，并添加經(jīng)過滅菌的20 mmol·L-1Mg2+溶液，再分別添加0.01、0.1、1、10、20、30 mmol·L-1Ca2+溶液，35 ℃下靜置培養(yǎng)1 d.結(jié)果表明，Ca2+能促進(jìn)生物膜合成，最優(yōu)Ca2+濃度為20 mmol·L-1(圖2D).

將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為5.0，高壓滅菌后接種菌液，并分別向培養(yǎng)基中添加20 mmol·L-1Mg2+溶液和20 mmol·L-1Ca2+溶液，同時分別添加2、4、6、8、10、12 g·L-1過濾除菌的葡萄糖溶液，35 ℃下靜置培養(yǎng)1 d.結(jié)果表明：LB培養(yǎng)基添加葡萄糖后，生物膜形成能力逐步上升，當(dāng)葡萄糖濃度為6 g·L-1時生物膜干重最大；當(dāng)葡萄糖濃度進(jìn)一步提高時，生物膜的形成能力逐漸下降，最后趨于平穩(wěn)(圖2E).

圖2 培養(yǎng)溫度(A)、pH值(B)、Mg2+濃度(C)、Ca2+濃度(D)和葡萄糖濃度(E)對生物膜形成的影響Fig.2 Effects of culture temperature (A),pH (B),Mg2+ concentration (C),Ca2+ concentration (D) and glucose concentration (E) on biofilm formation

2.3 正交試驗結(jié)果

從表2的R值可得，各因素對枯草芽孢桿菌生物膜形成的影響大小依次為初始pH值(D)>葡萄糖濃度(A)>Mg2+濃度(C)>Ca2+濃度(B)>溫度(E).由表3也可得，初始pH值對生物膜形成的影響程度最大(P<0.05).從k值可以看出，A因素表現(xiàn)為A4>A3>A2>A1，B因素表現(xiàn)為B3>B1>B2>B4，C因素表現(xiàn)為C2>C1>C3>C4，D因素表現(xiàn)為D4>D3>D2>D1，E因素表現(xiàn)為E1>E2>E3>E4.因此，最優(yōu)組合為A4B3C2D4E1(15號組合)，即葡萄糖濃度為12 g·L-1，Mg2+濃度為10 mmol·L-1，Ca2+濃度為1 mmol·L-1，培養(yǎng)基初始pH值為8.0，培養(yǎng)溫度為25 ℃.此外，通過肉眼觀察生物膜在氣液界面的形態(tài)(圖3)也可以發(fā)現(xiàn)，15號組合中生物膜最為致密、成熟.

表2 枯草芽孢桿菌生物膜形成優(yōu)化的正交試驗設(shè)計方案與結(jié)果1)Table 2 Design and results of orthogonal experiment for the optimization of B.subtilis biofilm formation

表3 正交試驗結(jié)果方差分析1)Table 3 ANOVA analysis of orthogonal experiment results

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前，研究生物膜常用的方法有試管法、定量檢測微孔板法、置片法等，這些方法能在一定程度上模擬生物膜的形成過程，但生物膜生長牢度不足，對生物膜形成的判斷偏主觀性，因而評估結(jié)果差異大，不夠準(zhǔn)確[16]，并且相同的細(xì)菌在不同培養(yǎng)方法中形成生物膜的能力差異較顯著[17].結(jié)晶紫法是觀察生物膜形成的常用方法，它可以快速直接地觀察到生物膜，但同時會出現(xiàn)染色不夠充分，在漂洗過程中生物膜容易脫落、丟失，不能完整保存等缺點.平板菌落計數(shù)法也被用于生物膜的檢測中，但由于大部分的微生物不可培養(yǎng)，可能造成檢測出的生物量遠(yuǎn)小于實際的生物量.烘干稱重法可以較為準(zhǔn)確地評價生物膜的形成，但其存在有效性較差的缺點.因此，需要結(jié)合多種方法開展生物膜的研究.

枯草芽孢桿菌生物膜的形成與其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、多糖等胞外基質(zhì)濃度有關(guān)[18].據(jù)報道，葡萄糖相較于其他碳源對生物膜活性影響最顯著[19].本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖在低濃度(2～6 g·L-1)時對生物膜形成表現(xiàn)為促進(jìn)作用，但過多葡萄糖則起抑制作用.金屬離子Mg2+和Ca2+可影響細(xì)菌芽孢的形成[15]，而枯草芽孢桿菌生物膜形成與其芽孢產(chǎn)生有關(guān)[20]，因此Mg2+和Ca2+濃度能間接影響生物膜形成.據(jù)報道，適當(dāng)濃度Ca2+可加快許多微生物形成速度[21-22].本試驗結(jié)果表明，低濃度(0.01～20 mmol·L-1)Ca2+對枯草芽孢桿菌生物膜形成表現(xiàn)為促進(jìn)作用，濃度大于20 mmol·L-1則表現(xiàn)為輕微抑制作用.與此類似，低濃度(1～20 mmol·L-1)Mg2+能夠提高生物膜形成能力，但當(dāng)其濃度大于20 mmol·L-1則會減弱生物膜形成能力.除了培養(yǎng)基成分會影響生物膜形成外，培養(yǎng)環(huán)境對其也有不同程度的影響.其中，pH值對生物膜形成的影響尤為顯著，弱酸性與中性環(huán)境中細(xì)菌形成最旺[23]；過高或者過低的溫度都不利于生物膜形成.

1～16的試驗方案見表2.圖3 16個正交組合所得生物膜比較Fig.3 Comparison on biofilms in 16 orthogonal combinations

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗設(shè)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)培養(yǎng)基中含12 g·L-1葡萄糖、10 mmol·L-1Mg2+、1 mmol·L-1Ca2+，且初始pH值為8.0，在25 ℃下培養(yǎng)時，生物膜的形成能力最強(qiáng)，此時生物膜干重為0.167 9 g，與空白對照相比，生物膜干重提高了40%.