林 瀚,王晶晶,黃華星,何碧珠,蘭思仁,馬曉開(kāi)

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)研究中心；2.福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院；4.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建 福州 350002)

金線(xiàn)蓮(Anoectochilusroxburghii)，隸屬于蘭科(Orchidaceae)蘭亞科(Orchidoideae)開(kāi)唇蘭屬(Anoectochilus)，是一種多年生草本植物，主要分布于中國(guó)、日本、斯里蘭卡、尼泊爾和印度等國(guó)，生于海拔50～1 600 m的常綠闊葉林下或溝谷陰濕處[1].金線(xiàn)蓮在我國(guó)作為傳統(tǒng)名貴藥材被人們廣泛種植，具有滋陰降火、清熱解毒、祛風(fēng)除濕、消炎止痛等多種功效，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用[2,3].在醫(yī)療上被應(yīng)用于治療和預(yù)防高血壓、腫瘤、糖尿病、小兒發(fā)育不良、風(fēng)濕病等癥[4].在民間富有“金草”、“藥王”等盛譽(yù)[5].從形態(tài)上來(lái)看，金線(xiàn)蓮植株小巧優(yōu)雅，金黃色的葉脈呈網(wǎng)狀排列[6]，具有較高的觀(guān)賞價(jià)值.此外，由于野生金線(xiàn)蓮結(jié)實(shí)率較低且種子萌發(fā)條件較為苛刻[7]，加上遭受人類(lèi)活動(dòng)的長(zhǎng)期破壞，目前金線(xiàn)蓮野生資源已經(jīng)處于極其瀕危狀態(tài)，其遺傳保育研究工作刻不容緩.

基因組是一個(gè)生物物種所有遺傳信息的總和，基因組大小的測(cè)算對(duì)象是該物種單倍體核的DNA含量，稱(chēng)為C值.其單位通常表述為堿基對(duì)的數(shù)目(bp)或質(zhì)量(pg)，是植物基本且重要的生物多樣性參數(shù)[8].在每個(gè)物種中，細(xì)胞的染色體數(shù)和DNA含量即C值是固定的，可用于評(píng)估生物體的生物學(xué)特征，為其基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究提供依據(jù)，是比較和進(jìn)化基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，還在物種的鑒定、分類(lèi)和進(jìn)化等方面有重要意義.常用的基因組C值測(cè)算方法有孚爾根光密度測(cè)量法、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光計(jì)量PCR法[9].流式細(xì)胞技術(shù)借助流式細(xì)胞儀和熒光染料，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究.事先制備好的細(xì)胞核懸液，使用特定熒光染料進(jìn)行染色后，于設(shè)定的壓強(qiáng)下進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室.細(xì)胞呈單列排序，經(jīng)由噴嘴噴出形成液流，細(xì)胞液流與入射激光束相交被激發(fā)出熒光，利用濾片收集各個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，測(cè)得的熒光強(qiáng)度即可換算出待測(cè)樣品的細(xì)胞核DNA含量[10].該技術(shù)操作簡(jiǎn)便高效、結(jié)果精準(zhǔn)，屬于目前基因組大小測(cè)定的主流方法.

目前，關(guān)于蘭科植物分子生物學(xué)、基因組學(xué)層面的研究才剛剛起步，一些重要類(lèi)群的基因組基本信息仍舊缺乏，與遺傳育種相關(guān)的研究還相對(duì)滯后.作為藥用、保育及觀(guān)賞價(jià)值較高的蘭科物種，亟待對(duì)其細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等層面進(jìn)行研究，探索其遺傳基礎(chǔ)和進(jìn)化規(guī)律.對(duì)于開(kāi)唇蘭屬植物的基因組DNA的C值含量和基因組大小的評(píng)估尚未開(kāi)展.本研究建立基于流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定金線(xiàn)蓮基因組大小的測(cè)定方法和流程，估算了金線(xiàn)蓮的DNA含量，為后續(xù)金線(xiàn)蓮和開(kāi)唇蘭屬植物的全基因組測(cè)序提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)森林蘭苑的蘭科種質(zhì)資源圃保存的福建野生金線(xiàn)蓮，嫩葉為試驗(yàn)待測(cè)對(duì)象,福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)研究中心的雞紅細(xì)胞核(chicken erythocyte nuclei,CEN,DNA 2C含量為2.5 pg)作為內(nèi)標(biāo).

1.2 試劑、耗材和儀器設(shè)備

試驗(yàn)所用到的主要試劑、耗材及儀器包括：LB01分離緩沖液[11]、Galbraith′s分離緩沖液[12]、WPB分離緩沖液[13]、碘化丙啶(propylene iodide,PI)熒光染色劑、雞紅細(xì)胞核(chicken erythocyte nuclei,CEN)、RNAase(美國(guó)，Sigma公司)、過(guò)濾膜(孔徑30 μm)、培養(yǎng)皿(直徑5 cm)、雙面刀片、試管(10 mL)、微量離心管(Eppendorf公司，1.5 mL)，及FACScalibur流式細(xì)胞測(cè)定儀(美國(guó)Becton-Dickinson,San Jose,CA公司)、Micro CL17型微量臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司).

1.3 緩沖解離液和熒光染料的制備

分別選用LB01分離緩沖液、Galbraith′s分離緩沖液、WPB分離緩沖液(表1)，對(duì)金線(xiàn)蓮的新鮮嫩葉進(jìn)行裂解測(cè)試，從中篩選最適合的金線(xiàn)蓮細(xì)胞測(cè)定的解離液.碘化丙啶(PI)具有非特異性標(biāo)記作用，可作為細(xì)胞核熒光染料，進(jìn)行基因組的絕對(duì)值測(cè)量[14]，使用的終濃度為50 μg·mL-1，存放于4 ℃冰箱中備用.在檢測(cè)核DNA含量前，需排除RNA干擾.因此在上機(jī)測(cè)定前需提前添加RNAase(工作液濃度50～150 μg·mL-1，貯存液1 mg·mL-1，-20 ℃保存)以降解RNA.

表1 3種細(xì)胞核裂解液的配方[11-13]Table 1 Components of 3 nuclear lysis buffers[11-13]

1.4 細(xì)胞核懸液制備與DNA特異性染色

細(xì)胞核懸液的制備與細(xì)胞核染色參照Dolezel et al[14]的方法進(jìn)行.取金線(xiàn)蓮的新鮮嫩葉4份，每份約0.5 g.用于放置的培養(yǎng)皿提前預(yù)冷，分別置入1 mL預(yù)冷的LB01、Galbraith′s、WPB分離緩沖液，使金線(xiàn)蓮葉片完全沒(méi)入液體中.用鋒利雙面刀片垂直迅速切碎并輕輕抽打，使得細(xì)胞核游離出細(xì)胞，過(guò)程中盡量避免小氣泡產(chǎn)生.吸取培養(yǎng)皿中含有細(xì)胞核的解離液于孔徑30 μm濾膜，進(jìn)行過(guò)濾，后收集濾液至1.5 mL微量離心管管中.通過(guò)冷凍離心機(jī)800 r·min-1離心5 min，棄掉上清，倒置于紙上將殘存液體瀝干，收集沉淀的細(xì)胞，再加入150 μL預(yù)冷解離液.將待測(cè)樣品與對(duì)照標(biāo)樣CEN進(jìn)行混合制樣(等比例混勻)，吸取250 μL混合液，逐次加入RNAase和0.5 μL預(yù)冷的PI染料(終濃度100 μg·mL-1)，進(jìn)行熒光染色.輕輕晃動(dòng)后置于4 ℃冰箱，避光孵育染色30 min，即可上機(jī)檢測(cè).

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)和基因組大小估算

通過(guò)流式細(xì)胞測(cè)定染色的細(xì)胞核懸浮液的熒光強(qiáng)度，所用儀器為美國(guó)BD公司產(chǎn)FACScalibur流式細(xì)胞儀.儀器提前預(yù)熱30 min，上機(jī)前樣品再手動(dòng)振蕩 5～10 s，設(shè)置參數(shù),PI激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm.通過(guò)掃描PI染色的1 000個(gè)懸浮的細(xì)胞核，收集FL2通道的熒光(FL2-A)，每個(gè)樣品重復(fù)4次，測(cè)得其熒光強(qiáng)度.PI染色劑嵌入DNA堿基對(duì)中，嵌入量信息反饋在熒光強(qiáng)度上，并和DNA含量形成正相關(guān)[15].每次檢測(cè)結(jié)束之后，用清洗液和去離子水充分清潔.有研究表明[16]，CEN的DNA 2C含量為2.5 pg，選擇CEN為內(nèi)標(biāo)作對(duì)照，固定其橫坐標(biāo)，與待測(cè)樣品金線(xiàn)蓮充分混勻后進(jìn)行檢測(cè)，即可根據(jù)峰的位置，參考已知基因組大小的CEN進(jìn)行比對(duì)，從而測(cè)得金線(xiàn)蓮基因組大小.隨后根據(jù)流式細(xì)胞儀測(cè)得的圖像和1 000個(gè)細(xì)胞核的測(cè)算數(shù)據(jù)，使用儀器自帶的CellQuest軟件進(jìn)行處理分析，獲得金線(xiàn)蓮測(cè)定樣本及內(nèi)標(biāo)的G0/G1期的峰值.最后按照下列公式，計(jì)算出金線(xiàn)蓮的基因組DNA含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 分離緩沖液和參考標(biāo)準(zhǔn)的篩選

流式細(xì)胞技術(shù)簡(jiǎn)便高效，上機(jī)結(jié)果直觀(guān)明晰.但在此之前，對(duì)細(xì)胞核懸浮液的選擇有較高的要求.不同的分離緩沖液對(duì)待測(cè)材料的解離效果具有差異，本研究需要找到更適合金線(xiàn)蓮的解離液.結(jié)合前人研究，本研究選取3種常用解離液(LB01分離緩沖液、Galbraith′s分離緩沖液、WPB分離緩沖液)進(jìn)行比較，由于植物細(xì)胞有細(xì)胞壁及眾多細(xì)胞器，蘭科植物更是富含高濃度的淀粉和多糖、多酚等物質(zhì)，這對(duì)核懸液提出了更高要求.針對(duì)這些特點(diǎn)進(jìn)行嘗試選用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Galbraith′s分離緩沖液對(duì)金線(xiàn)蓮幼嫩葉片的解離效果更好，較為完整地釋放了細(xì)胞核，且細(xì)胞碎片較少，干擾熒光少；而LB01、WPB分離緩沖液的解離效果一般.結(jié)合變異系數(shù)(CV值)，最后得出Galbraith′s分離緩沖液最優(yōu)；用CEN作為參照標(biāo)準(zhǔn)(內(nèi)標(biāo))與金線(xiàn)蓮嫩葉樣品混合后進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定，發(fā)現(xiàn)測(cè)試樣品與內(nèi)標(biāo)粒子的區(qū)分明確、清晰，且出峰穩(wěn)定，無(wú)重疊峰，峰型集中.因此使用CEN作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定金線(xiàn)蓮基因組大小方法合理，結(jié)果可靠.

2.2 基因組C值和大小的測(cè)定結(jié)果

以CEN為內(nèi)標(biāo)測(cè)定4組金線(xiàn)蓮樣品(圖1).其中二維散點(diǎn)圖中FSC-H通過(guò)前向角散射信號(hào)強(qiáng)度揭示細(xì)胞大?。恢狈綀D中FL2-A顯示染色后熒光信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，Counts值表示計(jì)數(shù).本研究根據(jù)混合樣品中CEN和待測(cè)金線(xiàn)蓮樣品的PI發(fā)射熒光強(qiáng)度的差異和峰值之間的相對(duì)關(guān)系，可計(jì)算得到：金線(xiàn)蓮基因組的2C DNA含量為(6.83±0.067 )pg(表2).為確保結(jié)果的可靠性，共進(jìn)行4次生物學(xué)重復(fù)測(cè)量，觀(guān)測(cè)浮動(dòng)值，以確保測(cè)量的穩(wěn)定性.另外，通過(guò)核DNA的含量換算(1 pg=0.978 Gb)可得金線(xiàn)蓮的基因組為(3.34±0.033) Gb.

3 討論

1983年，Galbraith et al[12]首次建立流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定植物DNA C值的方法.如今，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，越來(lái)越多的人們開(kāi)始對(duì)不同物種進(jìn)行基因組測(cè)序研究.因此需要更便捷高效的方法對(duì)植物基因組大小進(jìn)行前期估算、探索基因組特征.流式細(xì)胞技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，已成為測(cè)定植物基因組大小的標(biāo)準(zhǔn)方法[17].流式細(xì)胞技術(shù)也在植物遺傳及育種研究中取得了廣泛的應(yīng)用，不僅可以對(duì)基因組大小進(jìn)行測(cè)定，而且可以對(duì)植物的倍性和生殖途徑進(jìn)行鑒定和分析[18].通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)基因組大小，操作簡(jiǎn)便高速，能得到準(zhǔn)確直觀(guān)的結(jié)果，可重復(fù)性強(qiáng)，是一種高通量技術(shù)手段.但用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定植物基因組大小時(shí)，也出現(xiàn)過(guò)相同物種的測(cè)定結(jié)果間有所差異的案例[14,19]，這與多方面因素有關(guān).測(cè)定具有核內(nèi)多倍性的植物以及具有漸進(jìn)式局部核內(nèi)再?gòu)?fù)制(progressively partial endoreplication)的植物(如蘭科)基因組大小時(shí),技術(shù)上的挑戰(zhàn)更大[20].因此在試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)充分考慮樣品制備、細(xì)胞裂解方法和參標(biāo)選擇、混樣染色等問(wèn)題，盡可能減小誤差.

圖1 金線(xiàn)蓮和雞紅細(xì)胞混合樣品流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Fig.1 FCM detection images for the mixed samples of A.roxburghii and chicken erythocyte nuclei

表2 金線(xiàn)蓮的DNA 2C含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of the 2C values for A.roxburghii

首先，在測(cè)定前，選擇新鮮的金線(xiàn)蓮幼嫩葉片作為試驗(yàn)材料.使用幼嫩的植物組織可以有效避免組織成熟、老化后帶來(lái)的更高濃度的淀粉、多糖、多酚或其他代謝產(chǎn)物，減小誤差.樣品的制備和保存需要多加注意.

其次，裂解液(分離緩沖液)的選取也是相當(dāng)重要的，適當(dāng)?shù)牧呀庖耗芤种坪怂崦浮⒕S持細(xì)胞核的完整性并能提供核酸染料染色最佳條件，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確.目前國(guó)際上還沒(méi)有通用的植物細(xì)胞核裂解液，不同種屬、植物的不同部位所需要的裂解液也各不相同[21].因此本試驗(yàn)中，結(jié)合前人研究，選取3種裂解液進(jìn)行嘗試.試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Galbraith′s分離緩沖液的裂解效果最好，WPB分離緩沖液、LB01分離緩沖液效果相對(duì)一般.可以推測(cè)可能和Galbraith′s分離緩沖液中含有MgCl2有關(guān)，MgCl2可作為染色質(zhì)穩(wěn)定劑，保持細(xì)胞核的穩(wěn)定，并且其含有檸檬酸鈉和TritonX-100等物質(zhì)，能進(jìn)行通透處理，有效清洗，減少金線(xiàn)蓮中富含的糖類(lèi)、多酚等黏性雜質(zhì)，防止其與細(xì)胞核黏連[22]，降低了測(cè)定時(shí)信號(hào)的干擾，且其化學(xué)性質(zhì)比較溫和，也保障了細(xì)胞核的穩(wěn)定[23].WPB分離緩沖液雖然也含有MgCl2，但是裂解后細(xì)胞碎片較多，CV值較高，WPB還是更適用于木本植物細(xì)胞核的裂解.如經(jīng)多次嘗試發(fā)現(xiàn)結(jié)果仍不理想，應(yīng)考慮對(duì)現(xiàn)有分離緩沖液的配方進(jìn)行改進(jìn)，尋找其他成分以期獲得更佳的細(xì)胞核裂解效果.

分離緩沖液制備后,選擇PI作染料進(jìn)行熒光染色.PI染色劑可嵌入金線(xiàn)蓮細(xì)胞核的DNA，充分激發(fā)出熒光，供給流式細(xì)胞儀檢測(cè).PI染料也是目前DNA流式細(xì)胞術(shù)的常規(guī)染料.近年來(lái)，有毒性較低、分辨率更高的新染料出現(xiàn)，值得進(jìn)行更多試驗(yàn)和推廣[17].

在選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，本研究使用CEN作為內(nèi)標(biāo)來(lái)測(cè)定金線(xiàn)蓮的C值，所用內(nèi)標(biāo)均采用同一批標(biāo)準(zhǔn)樣本.測(cè)定結(jié)果表明，CEN與待測(cè)樣品無(wú)重疊峰，區(qū)分度較好，用其作為內(nèi)標(biāo)估算金線(xiàn)蓮基因組大小，準(zhǔn)確可靠.同時(shí)，為了降低試驗(yàn)誤差，測(cè)試材料均為活體植株新長(zhǎng)出的幼小葉片.如具備更好試驗(yàn)條件，內(nèi)標(biāo)選擇已知基因組大小的植物,會(huì)更為適合.盡量保證內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)樣品的基因組大小相近,但又不宜太近,防止混樣后測(cè)得的熒光峰重合.Dole?el et al[14]在所著文中提及的標(biāo)準(zhǔn)包含8種DNA含量在1.10～34.89 pg的植物，已經(jīng)穩(wěn)定用于植物基因組大小的測(cè)定.其研究機(jī)構(gòu)——捷克共和國(guó)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)研究所分子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，以種子的形式向全球科研者免費(fèi)提供這些標(biāo)準(zhǔn)植物樣本.這些植物的細(xì)胞學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，少有次級(jí)代謝產(chǎn)物，且種類(lèi)常見(jiàn)，是很好的參照材料.汪琛穎等[24]使用流式細(xì)胞術(shù)，以鐵皮石斛為參標(biāo)，以Galbraith′s緩沖液為解離液，測(cè)出蘭科蘭屬的蕙蘭(Cymbidiumfaberi)基因組DNA 2C含量為8.98 pg.該試驗(yàn)也指出Galbraith′s緩沖液裂解對(duì)參標(biāo)鐵皮石斛和待測(cè)材料蕙蘭的解離效果均最優(yōu).這與本試驗(yàn)對(duì)蘭科金線(xiàn)蓮的測(cè)定相類(lèi)似，可互為佐證.

目前，蘭科植物的細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和組學(xué)的研究多集中于傳統(tǒng)熱帶蘭品種，如蝴蝶蘭屬(Phalaenopsisssp.)和文心蘭屬(Oncidiumssp.)[25]，而對(duì)開(kāi)唇蘭屬的研究極少.已有研究主要集中在對(duì)其生理生化指標(biāo)(如成分含量)等進(jìn)行評(píng)價(jià)[26-28].作為開(kāi)唇蘭屬最為珍稀瀕危的金線(xiàn)蓮，其藥用、觀(guān)賞和保育價(jià)值非常顯著，因此應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)其相關(guān)領(lǐng)域的研究.2009年首個(gè)蘭科植物的全基因組草圖公布后[29]，經(jīng)過(guò)數(shù)年各方努力，科學(xué)家們克服了蘭科植物基因高雜合度的技術(shù)難題，陸續(xù)完成了4種蘭科植物的全基因組序列的組裝和分析，包括小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)[30]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[31-32]、深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)[33]、天麻(Gastrodiaelata)[34]等，獲得了高精度的基因組序列圖譜和大量的基因信息.作為被子植物第二大科[33]，蘭科植物在適應(yīng)環(huán)境，不斷進(jìn)化中形成了極高的豐富度，成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)，各類(lèi)群全基因組序列的破譯及進(jìn)化基因組學(xué)的研究將為揭示蘭科植物的起源、進(jìn)化及重要?jiǎng)?chuàng)新性狀的遺傳基礎(chǔ)及其分子機(jī)理提供強(qiáng)大的基因工具包.本研究利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)金線(xiàn)蓮基因組大小的測(cè)算方法進(jìn)行探索，最后成功估測(cè)金線(xiàn)蓮的C值和基因組大小.由于不同于模式植物，蘭科開(kāi)唇蘭屬在研究和試驗(yàn)上的參照數(shù)據(jù)有限，對(duì)金線(xiàn)蓮基因組基本特征的研究可為其進(jìn)一步的分子生物研究、種質(zhì)保育、基因挖掘等提供依據(jù).隨著測(cè)序成本的大幅下降，對(duì)開(kāi)唇蘭屬植物進(jìn)行全基因組測(cè)序已可提上日程.通過(guò)對(duì)金線(xiàn)蓮的基因組大小的測(cè)定，可提前預(yù)估測(cè)序成本，并為其測(cè)序方法、組裝策略的選擇等提供依據(jù)，也為將來(lái)開(kāi)唇蘭屬植物的細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究提供依據(jù).