田慧東 王獻

中南民族大學化學與材料科學學院

一、簡介類固醇激素

類固醇激素又稱甾體激素，是一類具有環(huán)戊烷多氫菲母核的四環(huán)脂肪烴化合物，是脂溶性小分子激素，同時它也具有極重要的醫(yī)藥價值[1]。類固醇激素主要由腎上腺、胎盤和生殖腺產(chǎn)生，它是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化代謝產(chǎn)生，通過內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)人體新陳代謝，在維持生命、調(diào)節(jié)性功能，機體發(fā)展、免疫調(diào)節(jié)等方面有明確的作用。類固醇激素包括糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)，鹽皮質(zhì)激素(醛固酮)，雄激素，雌激素和孕激素。膽固醇是類固醇激素的生物合成前體，有27個碳，而孕激素，鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素有21個碳，雄激素有18個碳，雌激素有19個碳。

內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病可導致體內(nèi)相應激素水平發(fā)生變化，如醛固酮增生癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、多囊卵巢綜合征等，臨床上可依此對一些疾病進行診斷和監(jiān)測。類固醇激素的異常主要可導致腎上腺疾病和性腺疾病。先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia)，簡稱CAH，是一組由腎上腺皮質(zhì)類固醇合成通路各階段各類催化酶的缺陷，引起以皮質(zhì)類固醇合成障礙為主的常染色體隱性遺傳性疾病。21-羥化酶缺陷是CAH中最常見的一種，該酶的缺陷會導致17α-羥孕酮、孕酮、雄烯二酮和脫氫異雄酮的濃度升高，而醛固酮、皮質(zhì)酮和皮質(zhì)醇的濃度降低。多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是一種常見的育齡期婦女的內(nèi)分泌疾病，以雄性激素過多、排卵功能障礙和多囊卵巢形態(tài)為主要臨床特點，臨床檢測發(fā)現(xiàn)睪酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮硫酸鹽的濃度會顯著升高。因此，臨床上通過對類固醇激素的檢測并分析了解它們之間的相互關聯(lián)，才能幫助醫(yī)生對相關疾病進行診斷和治療監(jiān)測。

二、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(HPLCMS)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用簡稱液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用通過液相色譜部分將分析物進行分離，再由質(zhì)譜進行檢測，最終得到質(zhì)譜圖。不同分析物其電離情況會有所不同，質(zhì)譜就是依據(jù)帶電物質(zhì)的質(zhì)量差異來進行分析識別的。英國物理學家Thomson最早提出質(zhì)譜的檢測原理。起初，質(zhì)譜儀僅僅能對一些分子量小且熱穩(wěn)定化合物進行檢測。隨著離子化技術的發(fā)展，出現(xiàn)了電噴霧離子化技術（ESI）和基質(zhì)輔助激光解析離子化技術（MALDI），至此，質(zhì)譜儀的應用范圍更加廣泛，在醫(yī)療檢測及疾病診斷方面發(fā)揮了重要作用。質(zhì)譜儀器的基本構成部分有進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等，質(zhì)譜儀器的不同關鍵在于離子源和質(zhì)量分析器的不同。

（一）離子源

質(zhì)譜檢測的基礎是分析物能夠被離子化，離子化是進行質(zhì)譜檢測的前提，因此離子源在質(zhì)譜儀器中的作用尤為重要。不同的離子源有不同的離子化方式。現(xiàn)在常用的離子化方法有:電噴霧電離（ESI）,基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI），大氣壓化學離子化（APCI）和大氣壓光離子化（APPI）等等。其中最常用的離子化方法是電噴霧電離。

（二）質(zhì)量分析器

質(zhì)量分析器位于離子源和檢測器之間，可以依據(jù)不同方式將離子源中生成的樣品離子按質(zhì)荷比（m/z）的大小分開，主要類型有磁分析器、飛行時間分析器、四極濾質(zhì)器、離子阱和離子迦旋共振分析器等。樣品離子經(jīng)質(zhì)量分析器分開后再進入檢測器，最終得到相應的質(zhì)譜圖。

液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢互補。色譜的優(yōu)勢在于對復雜樣品的分離，具有高分離能力，為混合物的分離提供了最有效的選擇。質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度，能夠提供物質(zhì)的相對分子質(zhì)量與結構信息。質(zhì)譜雖然所需樣品量比較小，但需要對樣品進行一定的前處理操作，去除一些影響測定的雜質(zhì)，只有滿足一定要求的樣品才可以進樣分析，否則會對儀器造成一定的損傷。

（三）液質(zhì)聯(lián)用的發(fā)展

伴隨著科學技術的發(fā)展，各種新興質(zhì)譜儀器不斷出現(xiàn)與改進，出現(xiàn)了多種類型的質(zhì)譜檢測器，它們的區(qū)別主要在質(zhì)量分析器。四級桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器和飛行時間質(zhì)量分析器是目前常見的幾種質(zhì)量分析器。不同類型的質(zhì)量分析器可以互相組合串聯(lián)，從而產(chǎn)生不同的質(zhì)譜儀，如:四級桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜等等。目前比較常用的質(zhì)譜儀器有:四極桿質(zhì)譜儀、四極桿離子阱質(zhì)譜儀、飛行時間質(zhì)譜儀和離子回旋共振質(zhì)譜儀等。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LCMS/MS）應用廣泛，在醫(yī)療、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測、化工生產(chǎn)等各個方面都有所體現(xiàn)。良好的液相色譜分離能力以及高特異性的串聯(lián)質(zhì)譜檢測，使得該技術有很好的復雜生物樣本的分析檢測能力。其中LC-MS/MS技術在臨床診斷方面發(fā)展勢頭尤為迅猛。

三、類固醇激素檢測方法的發(fā)展

類固醇激素在人體內(nèi)的含量很低，一般在nmol/L和pmol/L數(shù)量級,各種類固醇激素的分離和定量檢測也比較困難[2]。關于前處理方面，因液液萃取操作簡便，可對類固醇激素進行富集濃縮，其運用比固相萃取或者衍生化方法廣泛[3]。目前，測定類固醇激素常用的方法主要有生物法和化學法，生物法包括放射免疫測定法(radioimmunoassay,RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等，化學方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS/MS)[4]、液質(zhì)聯(lián)用法(high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)[7]。

圖1 超高壓液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀

21世紀[8]以來，用LC-MS/MS方法來檢測類固醇激素顯得更加普遍，因為LC-MS/MS方法通常更適合于生物樣品分析，同時具有較高的特異性。近年來，隨著超高液相色譜（UPLC）與靈敏度更高的質(zhì)譜聯(lián)用的出現(xiàn)，LC-MS/MS已成為甾體化合物分析的一種優(yōu)勢技術。目前對于類固醇激素的檢測，首選三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，其中超高壓液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（UPLCMS/MS）的使用更為廣泛（見圖1）。

目前主要采用的前處理方法有蛋白沉淀（PP），固相萃?。⊿PE）和液-液萃取（LLE）。

（一）蛋白沉淀法（PP）

蛋白沉淀法（PP）是最簡單的前處理技術，并且可以在96孔板中自動化大批量進行，同時還可以減少不必要的復雜的樣本轉(zhuǎn)移步驟。固相萃取法（SPE）和液-液萃取法（LLE）相對于PP的主要優(yōu)勢是能夠提供更干凈的樣本提取物，并且這兩種方法也有富集濃縮分析物的能力，從而提高檢測的靈敏度。由于用上述兩種技術提取的類固醇用的都是一些強溶劑不能直接注入LC-MS/MS儀器，因此氮氣吹干溶劑再用溶劑重構便成為這兩種方法的必要步驟，但是該方法也帶來了前處理的復雜性?，F(xiàn)在有一種微洗脫SPE方法，這種SPE方法因為柱填充所用材料較少能夠用較少量的溶劑洗脫吸附物質(zhì)，而這些少量的溶劑則可以在不影響靈敏度的情況下直接注入LC-MS/MS。

（二）液-液萃?。↙LE）

液-液萃?。↙LE）是在血液或者尿液等基質(zhì)中加入不混溶的有機溶劑，常用的有己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚等，從而將分析物提取出來。基于所需提取分析物來選擇合適的提取溶劑，可以獲得高回收率和可忽略的基質(zhì)效應。LLE雖然很有效，但是也有缺點比如難以自動化，需要使用通風廚來放出蒸汽溶劑等。

（三）固相萃取（SPE）

固相萃?。⊿PE）步驟包括：活化柱子，上樣樣本，淋洗，洗脫等步驟，是依賴于將分析物吸附在固定化的介質(zhì)中，然后將蛋白質(zhì)和基質(zhì)干擾物等淋洗到廢液中，最后用有機溶劑通常是甲醇和乙腈洗脫分析物?，F(xiàn)在可用的SPE裝置所用填料很多，比如疏水型的，離子交換型等固定相，如果在用SPE前處理時選擇與分析物相匹配的固定相，那么所獲得的樣本就會變得很干凈。SPE比LLE有著更加廣泛的適用性，但SPE有一個很大的缺點就是色譜柱成本相對于LLE更昂貴，SPE色譜柱既可以單獨的手動使用，也可以在96孔板中自動化進行，這種方式的前處理稱之為離線SPE。SPE也可以以在線的方式使用，在進樣的過程中使用弱溶劑淋洗SPE小柱通往廢液，然后再用閥門切換到分析柱中，切換至分析柱時用強溶劑洗脫分析物，使分析物經(jīng)分析柱進入質(zhì)譜，這樣就做到了樣本處理的自動轉(zhuǎn)換。無論是在線SPE還是在線SPE和LLE的組合，都不一定能獲得較高的分析物靈敏度。然而，在LC-MS / MS之前加上在線SPE 往往會大大縮短檢測所用的時間，其自動化程度和檢測激素的種類也都會大大提高，但是其方法的開發(fā)就比較繁瑣了。

結語：我們相信，超高壓液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）將在類固醇激素檢測中發(fā)揮至關重要的作用。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在類固醇激素的檢測中的優(yōu)勢主要在于高通量，高靈敏度，高精確度等等，它在食品檢測、臨床診斷和基礎研究等方面發(fā)揮了至關重要的作用，也將推動當今臨床醫(yī)療事業(yè)的蓬勃發(fā)展，對健康評估和疾病診斷均具有重要意義。未來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在類固醇激素的檢測中將向“操作簡單，步驟簡便，快而準出結果”等方面不斷改進與完善。