楊 光，張 昆，王 俊

1.淄博市第一醫(yī)院心胸外科，山東 淄博 255200；2.中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南250031

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的80%。盡管近年來(lái)針對(duì)肺癌的手術(shù)治療、放療和化療已取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但是患者5年生存率仍不足15%［2］。尋找肺癌潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1（prospero-related homeobox 1，PROX1）是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其基因位于染色體1q32.2～32.3上，對(duì)淋巴管的形成和發(fā)育起到重要作用［3］。既往研究［4-6］發(fā)現(xiàn)，PROX1在乳腺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡等密切相關(guān)。Zhu等［7］發(fā)現(xiàn)，PROX1在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲低PROX1基因后癌細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。PROX1在NSCLC中的表達(dá)水平及意義既往少有報(bào)道。本研究用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了NSCLC組織中PROX1的表達(dá)，探討PROX1與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。此外，本研究通過(guò)下調(diào)PROX1的表達(dá)觀(guān)察NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的變化，以期尋找潛在的NSCLC生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器

DF-12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司，Tris/EDTA修復(fù)液購(gòu)自北京盛科博源生物科技有限公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司，鼠抗人PROX1單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠快速制備試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，LipoFiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司，PROX1 si-RNA由上海吉馬制藥有限公司合成并提供，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）和transwell小室購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，CX41型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司，微孔板閱讀器購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份公司。

1.1.2 細(xì)胞

人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H460、H1229和H358，人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2b均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DF-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，每3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.1.3 組織樣本

選取2011年1月—2013年6月在淄博市第一醫(yī)院進(jìn)行擇期手術(shù)治療且資料完整的NSCLC患者86例，術(shù)前均未接受放化療或免疫治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為NSCLC。86例患者中男性50例，女性36例；年齡46～68歲，平均（57.98±9.04）歲；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期37例，Ⅰ～Ⅱ期49例；腫瘤直徑≥3 cm者55例，＜3 cm者31例；吸煙45例；腺癌48例，鱗癌38例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例。術(shù)中留取癌組織及配對(duì)的癌旁組織（距離癌組織≥5 cm［8］），組織石蠟標(biāo)本均由淄博市第一醫(yī)院病理科完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中PROX1的表達(dá)

石蠟切片厚度為4 μm，在70 ℃下烤片30 min，隨后進(jìn)行脫蠟處理。用Tris/EDTA修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，羊血清封閉30 min，加入鼠抗人PROX1單克隆抗體（1∶200）4 ℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37 ℃溫育30 min。隨后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液處理，蘇木紫復(fù)染。經(jīng)過(guò)脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀(guān)察。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例判斷PROX1表達(dá)情況。染色為陰性記0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0%～10%記1分、11%～50%記2分、51%～80%記3分、81%～100%記4分，將二者評(píng)分相乘得出最終結(jié)果：0分（陰性）；1～3分（弱陽(yáng)性）；4～8分（中等陽(yáng)性）；9～12（強(qiáng)陽(yáng)性）。0～3分低表達(dá)；4～12分為高表達(dá)［9］。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min后，12 000×g離心15 min后收集上清液。用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每孔上樣蛋白量為50 μg。經(jīng)凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉1 h，溫育一抗（鼠抗人PROX1單克隆抗體，1∶200），4 ℃過(guò)夜后棄去一抗，洗膜緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次。隨后室溫溫育二抗2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。以β-actin作為內(nèi)參，采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）儀對(duì)蛋白成像，采用Image J軟件分析灰度值。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

以2×105個(gè)細(xì)胞/孔將A549細(xì)胞接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染前用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1.8 mL無(wú)血清培養(yǎng)基。分別用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋10 μL LipoFiter和10 mL si-RNA（或者si-control），靜置5 min后將二者混勻，混合物加入6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染6 h。si-RNA序列為5’-GGACGGGAAGUUAGACAAAGA-3’；si-control序列為5’-GGAAGUUAGACAA AGAUGAGA-3’。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1 000個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中，培養(yǎng)3周，每3 d換液1次。當(dāng)出現(xiàn)菌落時(shí)停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛固定30 min，隨后用結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計(jì)每孔克隆數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞以10 000個(gè)/孔接種于24孔板中，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，培養(yǎng)24、48、72和96 h后，向每孔中添加10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用微孔板閱讀器在490 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（D）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.6 Transwell侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)

在transwell遷移板下室每孔中加入600 μL培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞鋪于transwell遷移板上室中，溫室培養(yǎng)24 h。棄去上室培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，隨后用4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。用棉簽拭去上室上層黏附的細(xì)胞，進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。對(duì)于侵襲試驗(yàn)，首先在transwell遷移板上室鋪基質(zhì)膠，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，侵襲48 h后進(jìn)行分析，步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析；等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量資料用重復(fù)測(cè)量方差分析；生存分析用Kaplan-Meier法，多因素分析用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PROX1在NSCLC中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，NSCLC組織和癌旁組織中PROX1有不同程度的表達(dá)，PROX1主要分布在細(xì)胞核里，在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)（圖1）。癌組織中PROX1陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性分別6例、25例、20例、35例；癌旁組織中分別48例、27例、8例、3例，癌組織中PROX1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織（Z=-8.021，P＜0.001）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Beas-2b相比，A549、H460、H1229和H358細(xì)胞系中PROX1蛋白表達(dá)水平明顯較高（P均＜0.05，圖2）。

2.2 PROX1與NSCLC臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系

PROX1高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的占比明顯高于低表達(dá)組（P＜0.05）。

COX多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和PROX1高表達(dá)是NSCLC患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。PROX1高表達(dá)組生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組（P＜0.001，圖3，表1、2）。

2.3 下調(diào)PROX1對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-control組比較，si-RNA組PROX1蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)目、培養(yǎng)第72和96 h時(shí)細(xì)胞增殖的D值、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量明顯較低（P＜0.01，圖4～5）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PROX1在NSCLC組織中的表達(dá)Fig.1 PROX1 expression in NSCLC tissues detected by immunohistochemistry

圖2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PROX1蛋白表達(dá)水平（n=4）Fig.2 Western blot detection of PROX1 protein expression in cells (n=4)

圖3 PROX1高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存時(shí)間比較Fig.3 Comparison of survival time between patients with high and low PROX1 expression

表1 PROX1與NSCLC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between PROX1 and clinicopathological characteristics of NSCLC［n (%)］

表2 NSCLC患者生存時(shí)間的影響因素分析Tab.2 Analysis of factors influencing the survival time of NSCLC patients

圖4 敲降PROX1對(duì)A549細(xì)胞PROX1蛋白表達(dá)水平的影響（n=4）Fig.4 The effect of knockdown PROX1 on the expression level of PROX1 protein in A549 cells (n=4)

圖5 敲降PROX1對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（n=4）Fig.5 Effect of knockdown PROX1 on proliferation,migration and invasion of A549 cells (n=4)

3 討 論

肺癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中PROX1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，并且PROX1與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移有關(guān)，可能成為NSCLC潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物。

PROX1在1996年首次被分離，是果蠅的同源異形盒基因prospero在哺乳動(dòng)物中的同源框基因轉(zhuǎn)錄因子。PROX1在乳腺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［4-6］。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了86例NSCLC組織中PROX1的表達(dá)，結(jié)果顯示，癌組織中PROX1高表達(dá)55例（63.95%），癌旁組織高表達(dá)11例（12.79%），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，與人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2b相比，A549、H460、H1229和H358細(xì)胞系中PROX1蛋白表達(dá)水平明顯較高。本研究還發(fā)現(xiàn)，敲低PROX1基因后，A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲明顯受到抑制。說(shuō)明PROX1可能作為癌基因參與NSCLC的發(fā)生。

PROX1在癌癥中的作用機(jī)制尚未明了，可能為：①結(jié)合并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-14表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤血管生成和腫瘤侵襲［10］；②通過(guò)核小體重塑和去乙?；笍?fù)合物抑制Notch信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［11］；③參與免疫炎癥損傷，通過(guò)激活核因子κB促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖和侵襲；④表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，參與腫瘤淋巴管新生和腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移［3］。

本研究結(jié)果顯示，PROX1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)。在多種類(lèi)型腫瘤中，淋巴管是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑。PROX1主要分布在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞核里，在腫瘤組織內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［12］。既往研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，PROX1有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化和淋巴管形成的作用，可能會(huì)作為預(yù)測(cè)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。本研究86例患者中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例，其中PROX1高表達(dá)10例，占83.33%；未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的74例患者中PROX1高表達(dá)45例，占60.81%，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)。

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NSCLC患者不良生存預(yù)后的影響因素，既往已被證實(shí)［15-17］。PROX1高表達(dá)與多種腫瘤的不良生存預(yù)后有關(guān)，如乳腺癌［18］、胃癌［19］和唾液腺樣囊性癌［20］等。本研究COX多因素分析結(jié)果顯示，PROX1是NSCLC患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素，PROX1高表達(dá)組生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組。

綜上所述，PROX1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用，敲降PROX1基因可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。PROX1與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期有關(guān)，PROX1高表達(dá)可能預(yù)示患者不良生存預(yù)后。本研究也存在一些局限性，例如未分析PROX1下游分子的變化，臨床樣本量較小。未來(lái)需要深入探討PROX1在NSCLC中的作用機(jī)制。