李建芳，周楓，張陽(yáng)陽(yáng)，陳利軍，劉坤峰

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽(yáng)464000；2.河南省豫南特色食物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，河南信陽(yáng)464000；3.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，河南信陽(yáng)464000；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

葫蘆巴（Trigonellafoenum-graecum L.）系豆科蝶形花亞科一年生草本植物[1]。已從胡蘆巴中分離和研究了多種有效成分，主要包括生物堿、皂苷和黃酮類(lèi)化合物，這些成分已被證實(shí)其潛在的藥用價(jià)值[2]。除了其已知的藥用價(jià)值，如胃興奮劑、抗糖尿病和半乳糖（乳糖誘導(dǎo)）效應(yīng)外，最新的研究已經(jīng)確定了低膽固醇血癥、抗脂血癥、抗氧化劑、護(hù)肝、抗炎、抗菌、抗真菌、抗?jié)儭⒖菇Y(jié)石、抗癌藥和其他雜酚的藥物作用[3]。這些研究大多使用了種子粉末或不同形式的提取物，而對(duì)其葉子揮發(fā)性成分研究的很少。因此，對(duì)葫蘆巴葉揮發(fā)性成分的提取、組分分析及其生物活性的研究很有必要。

早在1985年，P.Girardon等采用頂空萃取法和常壓水蒸汽蒸餾法從葫蘆巴種子中獲得揮發(fā)性物質(zhì)，共鑒定出39種成分[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)葫蘆巴揮發(fā)油也相繼開(kāi)展了大量研究。如陳靈等采用頂空固相微萃取法（headspace solid-phase microextractio，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析3個(gè)產(chǎn)地葫蘆巴種子的揮發(fā)性成分，共鑒定出31種化學(xué)成分，其中僅有惕各醛、惕各醇、正己醛、正己醇、2-正戊基呋喃等5種成分相同[5]；劉世巍等分別采用超聲-索氏抽提組合法和超臨界萃取法從寧夏產(chǎn)葫蘆巴種子中提取揮發(fā)油，利用GC-MS分析其化學(xué)成分，共鑒出26種化合物，包括胺類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)。其中，正丁基-烴基甲苯含量最高，達(dá)到66.04%[6]。RiadhMebazaa等在不同條件下采用溶劑萃取和靜態(tài)頂空固相微萃取兩種方法提取葫蘆巴中的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)提取的揮發(fā)物進(jìn)行了定性鑒別，共鑒定出67種化合物，其中一些首次在葫蘆巴種子中報(bào)道（如吡嗪、2，5-二甲基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮、蓽澄茄油烯醇）[7]。以上這些研究主要針對(duì)葫蘆巴種子，且研究發(fā)現(xiàn)，不同方法、不同產(chǎn)地、不同部位萃取獲得的葫蘆巴揮發(fā)性提取物化學(xué)成分具有明顯的差異性。

植物揮發(fā)性物質(zhì)提取的方法有水蒸氣蒸餾法（hydro-distillation，HD）、同時(shí)蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）、有機(jī)溶劑萃取法（solvent extraction，SE）、超聲波輔助萃取法（ultrasound-assisted extraction，UAE）、超臨界 CO2萃取法（supercritical carbon dioxide extraction，SFE-CO2）、微波萃取法（microwave-assisted extraction，MAE）等，不同提取方法得到的揮發(fā)油成分不同，且表現(xiàn)出的生物活性也不同。近年來(lái)，植物性揮發(fā)性物質(zhì)的提取主要采用水蒸氣蒸餾法，提取工藝過(guò)于單一，且提取溫度高、提取時(shí)間長(zhǎng)、系統(tǒng)開(kāi)放，易造成熱不穩(wěn)定或易氧化成分的破壞及揮發(fā)損失，對(duì)部分組分有破壞作用[8]。而同時(shí)蒸餾萃取法是將水蒸氣蒸餾與溶劑萃取二合為一，從而減少試驗(yàn)步驟，縮短萃取時(shí)間，節(jié)省萃取溶劑，并簡(jiǎn)化設(shè)備[9]。

本研究采用乙醚-水蒸汽同時(shí)蒸餾萃取，配合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）系統(tǒng)分析了葫蘆巴葉中揮發(fā)性成分，并研究其抗氧化活性，旨在更好地開(kāi)發(fā)和利用葫蘆巴提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料

葫蘆巴葉（干燥）：印度MDH。

1.2 化學(xué)試劑

無(wú)水乙醚、二氯甲烷、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、三氯乙酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、過(guò)硫酸鉀（均為分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液[tris（hydroxymethyl）aminomethane-HCl，Tris-HCl]：上海恪敏生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 [1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；維生素C：北京索萊寶科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽 [2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

同時(shí)蒸餾萃取裝置（見(jiàn)圖1）；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；HDM-1000 B恒溫電熱套：常州榮華儀器制造有限公司；Agilent 6850/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；YLJYE-100水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；JCS-6102 B電子分析天平：哈爾濱眾匯衡器有限公司；TU-1901分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；TGL-16C離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

圖1 同時(shí)蒸餾裝置示意圖Fig.1 Diagram of a simultaneous distillation and extraction unit

1.4 方法

1.4.1 提取方法

蒸餾萃取裝置的一端連接盛有50 g樣品加入一定量的蒸餾水在1 000 mL圓底燒瓶中，另一端接用250 mL的圓底燒瓶里面裝40 mL乙醚，樣品那一端用恒溫電熱套加熱，乙醚端用60℃水浴鍋加熱，蒸餾萃取2 h。萃取完成后，把U型管中的混合液也倒入盛有乙醚端，取下加入無(wú)水硫酸鈉干燥萃取液，冷凍過(guò)濾，濾液在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得揮發(fā)性物質(zhì)[10-11]，平行3次，合并3次試驗(yàn)所得樣品。

1.4.2 揮發(fā)性成分得率的計(jì)算方法將得到的揮發(fā)性提取物按照式（1）計(jì)算其得率。

式中：A為提取得到的揮發(fā)性成分質(zhì)量，g；B為葫蘆巴樣品的質(zhì)量，g。

1.4.3 GC-MS成分分析方法

將提取得到的揮發(fā)性成分用無(wú)水乙醚進(jìn)行稀釋?zhuān)? μL稀釋后的精油分別進(jìn)行GC-MS成分分析。

色譜條件：色譜柱，DB-5（60m×0.25mm×0.25μm）；載氣He；進(jìn)樣量1.0L；分流比 20∶1；柱流速 0.8mL/min；程序升溫為，初始溫度50℃，保持3 min，以10℃/min至260℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：EI電離能量70 eV，離子源溫度230℃，溶劑延遲5 min，掃描離子質(zhì)量范圍35 amu～550 amu，質(zhì)譜庫(kù)NIST06，傳輸線溫度280℃，進(jìn)樣口溫度260℃。用色譜峰面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的相對(duì)含量。利用Nist14譜庫(kù)對(duì)采集到的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索。

1.4.4 抗氧化能力測(cè)定

揮發(fā)性成分的稀釋與準(zhǔn)備[12]：精確稱(chēng)取20 mg的葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物，加入一定量的DMSO，稀釋成不同質(zhì)量濃度。

1.4.4.1 總還原力的測(cè)定

取2.5 mL不同稀釋度的樣品提取液加入到裝有2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）的試管中，再加入2.5 mL的鐵氰化鉀溶液（1%）混合均勻反應(yīng)后，50℃水浴20 min后，加入2.5 mL的三氯乙酸（1%），在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液5 mL，與4 mL的蒸餾水和0.5 mL的三氯化鐵溶液（0.1%）混合，反應(yīng)10 min后，在700 nm處測(cè)吸光度[12-13]。用相同濃度的抗壞血酸水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每組平行3次。

1.4.4.2 DPPH的清除作用

在3 mL DPPH無(wú)水乙醇溶液（0.1 mmol/L）中，加入1 mL不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)性樣液，立即混勻，在室溫條件下避光放置30 min后，于517nm處測(cè)定吸光值（A）；以無(wú)水乙醇代替揮發(fā)性樣液，測(cè)定吸光值（A0）[14]。用相同濃度的抗壞血酸水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。每組平行3次。

DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

1.4.4.3 超氧陰離子自由基的清除作用

將1 mL不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)性樣液分別與3 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）混合，25℃恒溫10 min，加入1 mL 25℃預(yù)熱的鄰苯三酚（6 mmol/L），迅速搖勻，于320 nm處測(cè)定吸光值（A）（每隔30 s測(cè)定一次），以無(wú)水乙醇代替揮發(fā)性樣品，測(cè)定吸光值（A0）[15]。用相同濃度的抗壞血酸水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。每組平行3次。

超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率，即未加樣液時(shí)每分鐘增加的吸光值；ΔA為加入樣液后鄰苯三酚的自氧化速率，即加入樣液后每分鐘增加的吸光值。

1.4.4.4 ABTS+自由基的清除作用

將 ABTS儲(chǔ)備液（7.4 mmol/L）和過(guò)硫酸鉀（2.6 mmol/L）按體積比1∶1混合，25℃下避光靜置12 h，置于4℃下備用。取揮發(fā)性樣液1 mL于試管中，加入4.5 mL的ABTS儲(chǔ)備液（用無(wú)水乙醇將儲(chǔ)備液稀釋至734 nm處吸光值為0.7±0.02），立即混勻，室溫下避光6 min，于734 nm處測(cè)定吸光值（A）；以無(wú)水乙醇代替揮發(fā)性樣液，測(cè)定吸光值（A0）[15]。用相同濃度的抗壞血酸水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。每組平行3次。

ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性提取物得率與形態(tài)

按1.4.1萃取得到葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物的提取率為（0.373±0.098）%，25℃條件下葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物（見(jiàn)圖2）為液態(tài)，呈淡黃色，具有特殊的芳香氣味，持久性強(qiáng)，且?guī)в写碳ば?。這可能是SDE萃取過(guò)程中有機(jī)溶劑（乙醚）的作用使揮發(fā)性提取物氣味變得不純正的緣故。

2.2 GC-MS成分分析結(jié)果

將SDE法萃取得到的揮發(fā)油按1.4.3在色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行GC-MS分析，得總離子流（total ion current，TIC）色譜圖見(jiàn)圖3。采用1.4.3中GC-MS定性分析方法，對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的相對(duì)百分含量見(jiàn)表1，并對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分分類(lèi)見(jiàn)圖4。

圖2 SDE葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物Fig.2 Volatile chemical constituents from the leaf of Trigonella foenum-graecum L.by SDE

圖3 葫蘆巴葉揮發(fā)性成分的GC-MS總離子圖Fig.3 Total ion flow diagram of volatile chemical constituents from the leaf of Trigonella foenum-graecum L.by GC-MS

表1 SDE葫蘆巴葉揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in the leaf of Trigonella foenum-graecum L.

GC-MS結(jié)果顯示，葫蘆巴葉SDE揮發(fā)性中共檢出25個(gè)色譜峰，鑒定出23種物質(zhì)，占總量的96.497%。

續(xù)表1 SDE葫蘆巴葉揮發(fā)性成分Continue table 1 Volatile components in the leaf of Trigonella foenum-graecum L.

圖4 葫蘆巴葉揮發(fā)性成分的化學(xué)分類(lèi)分布Fig.4 Chemincal class distribution of volatile components in the leaf of Trigonella foenum-graecum L.

由圖4可以看出，其主要包括腈類(lèi)、萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、硫醚類(lèi)、烷類(lèi)等。其中，腈類(lèi)1種（芐基腈），占42.914%，占比最大；其次為萜烯類(lèi)3種，占 17.19%，包括（+）-4-蒈烯（11.749%）、香豆素（3.773%）和茴香腦（1.668%）；醇類(lèi) 5種，占 15.183%，包括桉葉醇（8.774%）、芳樟醇（1.903%）、苯乙醇（1.197%）、松油烯-4-醇（1.779%）和松油醇（1.530%）；酚類(lèi)3種，占10.62%，包括麝香草酚（5.321%）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4.584%）、丁香酚（0.717%）；硫醚類(lèi)4種，占7.010%，包括（Z）-仲丁基二硫醚、€-仲丁基二硫代二硫醚、二甲基1-（甲硫基）丙基二硫醚和二（1-甲基丙基）二硫化物；醛類(lèi)3種，占1.829%，包括苯甲醛、苯乙醛、4-（1-甲基乙基）-苯甲醛；酯類(lèi)1種（2-降冰片酯），占 0.575%；烷類(lèi) 1種（5-乙基-2，3，4，6-四硫庚烷），占 0.255%；異硫氰酸類(lèi) 1 種，（異硫氰酸甲基）-苯，占0.26%；其他1種，占0.661%。由表1可以看出，SDE揮發(fā)油中相對(duì)含量最高的化學(xué)成分是芐基腈（42.914%），其次為（+）-4-蒈烯（11.749%）、桉葉醇（8.774%）、麝香草酚（5.321%）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4.584%）和香豆素（3.773%）等。

本研究首次采用溶劑-蒸餾同時(shí)蒸餾法萃取葫蘆巴葉中揮發(fā)性成分，與前人[16-17]對(duì)葫蘆巴種子的研究結(jié)果有很大差異。

本研究從葫蘆巴葉子中檢出（+）-4-蒈烯（11.749%）、桉葉醇（8.774%）、麝香草酚（5.321%）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4.582%）和香豆素（3.773%），相對(duì)含量較高，這些物質(zhì)已證實(shí)具有一定的生物活性，尤其表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化和抑菌活性[18-21]。

本研究首次在葫蘆巴葉中發(fā)現(xiàn)含量極高的芐基腈（42.914%）。有研究報(bào)道，桔花精油[22]和茉莉精油中含有芐基氰；Huguette Agnaniet等在對(duì)五倍子精油和高斯核果木精油化學(xué)成的研究中發(fā)現(xiàn)，在提取揮發(fā)油過(guò)程中沸騰1 h后，仍含有29%的異硫氰酸芐酯，而蒸餾結(jié)束時(shí)其含量?jī)H低于2%；且隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)，芐基腈生成量越多[23]。芐基腈可能是氰化物離子與異硫氰酸芐酯反應(yīng)生成的，異硫氰酸酯衍生物通常存在于十字花科植物中[24]。且在本研究中發(fā)現(xiàn)葫蘆巴葉揮發(fā)性成分中存在有異硫氰酸類(lèi)物質(zhì)。因此，在本研究中鑒定出芐基腈是無(wú)疑的。

2.3 抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 總還原力

不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)性提取物和陽(yáng)性對(duì)照的總還原力如圖5所示。

由圖5可知，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物及對(duì)照組的總還原力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)效應(yīng)，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物的質(zhì)量濃度越大則總還原力越強(qiáng)，但其劑量效應(yīng)性關(guān)系顯著低于VC。葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物在所試濃度范圍（0.063 mg/mL～2.000 mg/mL）內(nèi)吸光值從（0.192±0.019）升至 （0.338±0.012），而 VC（0.316±0.022）～（0.622±0.016）的變化更明顯。一般情況下，吸光值越大，說(shuō)明其還原力越大，抗氧化性則越強(qiáng)[25]。由圖5可以看出，在相同濃度下?lián)]發(fā)性提取物的總還原力明顯小于VC。這說(shuō)明葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物具有一定的氧化作用，但低于VC。

圖5 揮發(fā)性提取物的總還原力Fig.5 The total reducing power of the volatile extracts

2.3.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH是很穩(wěn)定的氮中心的自由基，其弧對(duì)電子在517 nm波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，弧對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱。因此，通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度，來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性。不同質(zhì)量濃度的葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物和陽(yáng)性對(duì)照對(duì)DPPH自由基清除率見(jiàn)圖6。

圖6 揮發(fā)性提取物的DPPH自由基清除率Fig.6 The clearance of DPPH free radical of the volatile extracts

由圖6可知，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加其清除作用增強(qiáng)，兩者呈明顯的量效關(guān)系。葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物在所試濃度范圍（0.25 mg/mL～8.00 mg/mL）內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除率從（3.088±0.995）%升至（46.065±1.723）%，而VC（5.623±1.082）%～（91.311±2.506）%的變化更為明顯。在質(zhì)量濃度為8.0%時(shí)，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為（46.065±1.723）%，而 VC可達(dá)到（91.311±2.506）%，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物對(duì)DPPH自由基的清除率遠(yuǎn)低于VC。

2.3.3 超氧陰離子自由基的清除作用

不同質(zhì)量濃度的葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物和陽(yáng)性對(duì)照對(duì)超氧陰離子自由基的清除率見(jiàn)圖7。

圖7 揮發(fā)性提取物超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7 The cleanance of super oxide anion free radical scavenging of the volatile extracts

由圖7可以看出，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，具有明顯的量效關(guān)系。葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物在所試濃度范圍（0.25 mg/mL～8.00 mg/mL）內(nèi)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率從（18.162±1.532）%升至（82.239±2.304）%，與VC（36.020±1.341）%～（88.670±2.595）%相比，其變化更為明顯。由圖8可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí)，揮發(fā)性提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)到（82.239±2.304）%，VC為（88.670±2.595）%。兩者清除超氧陰離子自由基的能力趨于近似。

2.3.4 ABTS+自由基的清除作用

不同質(zhì)量濃度的葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物和陽(yáng)性對(duì)照對(duì)ABTS+自由基的清除率見(jiàn)圖8。

圖8 揮發(fā)性提取物的ABTS+的清除作用Fig.8 The cleavance of ABTS+free radical scavenging

由圖8可以看出，葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，具有明顯的量效關(guān)系。葫蘆巴葉揮發(fā)性提取物在所試濃度范圍（0.016 mg/mL～0.500 mg/mL）內(nèi)對(duì) ABTS+自由基的清除率從（40.892±0.973）%升至（91.239±2.565）%，與VC[（68.033±1.163）%～（95.015±1.595）%]相比，其變化更為明顯。由圖8可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時(shí)，揮發(fā)性提取物對(duì)ABTS+自由基的清除率趨于平緩，約為90%；而VC對(duì)ABTS+自由基的清除率在其質(zhì)量濃度為0.063 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，隨著濃度的增加幾乎無(wú)顯著變化。

3 結(jié)論

同時(shí)蒸餾萃取法提取得到的葫蘆巴葉揮發(fā)性物質(zhì)為液態(tài)，呈淡黃色，得率為0.37%，具有濃郁的芳香氣味且略帶刺激性。GC-MS分析結(jié)果顯示，同時(shí)蒸餾萃取法共檢出25種物質(zhì)，主要包括腈類(lèi)、萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)、醚類(lèi)等。其中，腈類(lèi)有1種，占總含量的42.914%，占比最大；含量最多的為芐基腈（42.914%），其次為（+）-4-蒈烯（11.749%）、桉葉醇（8.774%）和麝香草酚（5.321%）等。大部分為分子質(zhì)量200以下的小分子物質(zhì)。

葫蘆巴葉揮發(fā)性物質(zhì)總還原力、對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）、ABTS+自由基的清除能力與質(zhì)量濃度均呈量效關(guān)系，但總體上，其抗氧化能力較陽(yáng)性對(duì)照VC小。