林曉為 謝云青 黃麗潔 陳雪芳 鄭秋紅

腫瘤浸潤的淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)指的是從腫瘤組織中分離出的浸潤性淋巴細胞，在90年代中期由NIH的Rosenberg 發(fā)現(xiàn)的,并顯示了良好的臨床效果[1]，是國內(nèi)外惡性腫瘤細胞免疫治療的熱點之一。尋找腫瘤特異的TIL細胞是提高TIL細胞臨床有效率的關(guān)鍵，但是目前還沒有特異的表面標志物。有研究顯示，對腫瘤抗原起特異性免疫反應(yīng)的T細胞克隆主要為CD8+效應(yīng)性T細胞，且CD8+TIL細胞中PD-1+的細胞亞群比PD-1-的細胞亞群對腫瘤細胞的殺傷能力更強[2-3]。

Rosenberg 等利用外顯子測序等手段得到可以識別新抗原的T 細胞的TCR序列后，將該TCR 導(dǎo)入到T 細胞中，大量克隆后進行抗腫瘤治療，該方法可規(guī)避由于脫靶效應(yīng)造成的毒副作用[4]。TCRα、β鏈基因的可變區(qū)(V) 各有3個互補決定區(qū)(complementarities determining region,CDR)，只有CDR3直接和抗原相互作用。TIL細胞的CDR3區(qū)受腫瘤抗原的長期編輯，其基因可能蘊含著豐富的個體化特異性抗原信息，且由于腫瘤抗原激活后的T細胞可得到優(yōu)勢擴增，因此TIL細胞中CDR3區(qū)的多樣性較正常人明顯降低，使利用CDR3區(qū)的基因突變信息尋找腫瘤突變的新抗原成為可能。

因此，本研究利用CD8、PD-1抗體分選出腫瘤組織來源的CD8+PD-1+TIL及CD8+PD-1-TIL細胞亞群，在體外對其特異性腫瘤殺傷功能進行驗證比較。同時，為了獲取腫瘤特異性的TCR信息，本研究嘗試建立體外PCR擴增體系,擴增CD8+PD-1+TIL細胞的TCR CDR3區(qū)基因，為后續(xù)的TIL細胞TCR CDR3區(qū)基因測序，尋找個體化腫瘤突變新抗原信息奠定前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 腫瘤組織來源TIL細胞的分離培養(yǎng)與表型鑒定

抗人CD3單克隆抗體及GT-T551 H3培養(yǎng)基均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，白介素-2(IL-2)購自北京四環(huán)制藥有限公司，淋巴細胞分離液購自美國General Electric(GE)公司。0.25%胰酶和膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶及DNA酶購自Gibco公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自廈門泰京公司。流式細胞儀(Beckman Coulter FC500)及流式檢測所用CD3-PC5、CD4-PE、CD8-ECD、PD-1-FITC均購自Beckman公司。

參照[5]的培養(yǎng)方法，無菌條件下獲取肺癌腫瘤組織，置于冰盒轉(zhuǎn)運至細胞培養(yǎng)室；將腫瘤組織剪成約1 mm3的小碎塊，加入膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNA酶等消化，4 ℃過夜；室溫1 500 r/min離心，5 min，收集細胞；采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞(包括腫瘤細胞和淋巴細胞)。將單個核細胞按1×106個/ml重懸于GT-T551 H3培養(yǎng)液中37 ℃，5% CO2條件下過夜，次日，收集上清液，貼壁細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)并擴增。離心收集上清中的細胞，重懸于GT-T551 H3培養(yǎng)液，加入CD3單克隆抗體(5 μg/ml)及IL-2(500 U/ml)誘導(dǎo)TIL細胞的活化和增殖。根據(jù)生長情況每 2～3 d 進行一次擴瓶傳代培養(yǎng)；在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)細胞，當(dāng)細胞不再呈指數(shù)級增長時，收集細胞進行表型鑒定。

大約培養(yǎng)至21 d左右，TIL細胞不再呈指數(shù)級增長，1 500 r/min離心5 min收集細胞，細胞沉淀用PBS洗滌3遍后，用PBS調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106，加入鼠抗人CD3-PC5、CD4-PE、CD8-ECD、PD-1-FITC單抗，室溫下孵育10 min后，加入1 ml PBS洗滌細胞，1 500 r/min離心5 min后，棄上清，細胞沉淀重懸于500 μl PBS中，上機檢測。

1.2 TIL細胞的功能鑒定

流式檢測所用CD8-ECD、IFN-γ-PC7、TNF-α-PC5抗體及細胞因子檢測試劑盒均為Beckman公司。實時無標記細胞分析(RealTime Cellular Analysis，RTCA)儀及E-Plate檢測板由艾森公司提供。

TIL細胞細胞因子分泌水平的檢測。收集培養(yǎng)21 d的TIL細胞進行細胞因子分泌水平的檢測。調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106于新鮮培養(yǎng)基中，加入PMA(10 ng/ml)和Ionomycin(1 μM)刺激24 h，離心收集細胞，用100 μl PBS調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106，加入10 μl CD8-PC5單抗于管中，孵育10 min后，加入1 ml PBS并離心收集細胞。細胞沉淀加固定劑，室溫暗處孵育15 min，離心500 g 5 min，棄上清；再加破膜劑溫暗處孵育10 min，加2～3 ml PBS洗液，離心500 g 5 min，棄上清；最后加入IFN-γ-FITC、IL-4-PE抗體，混勻，室溫暗處孵育30 min，加入1 ml PBS 洗液，離心500 g 5 min，棄上清，再加入500 μl含1%PFA的溶液重懸細胞沉淀，上機檢測。

TIL細胞亞群殺傷功能的檢測。應(yīng)用RTCA分析技術(shù)進行TIL細胞亞群殺傷效應(yīng)的檢測。向E-Plate檢測板中加入RPMI1640培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。收集1.2中貼壁生長的對數(shù)期原代肺癌腫瘤細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度，向E-Plate檢測板中加入一定體積的細胞，室溫超凈臺內(nèi)放置30 min。將加入細胞的E-Plate檢測板放入檢測臺上，進行實時動態(tài)的細胞增殖檢測。過夜檢測后，向各培養(yǎng)孔中加入PBMC、未分選TIL細胞、CD8+PD-1-TIL細胞及CD8+PD-1+TIL細胞四種效應(yīng)細胞進行共同培養(yǎng)，效靶比均為20∶1，并繼續(xù)進行實時監(jiān)測,共監(jiān)測48h，獲得實時的細胞效應(yīng)曲線。

1.3 CD8+PD-1+TIL細胞表面TCR Vɑ1鏈CDR3基因的擴增

PCR儀為ABI美國應(yīng)用生物公司，提取細胞總RNA的提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴增試劑盒均購自美國Promega公司。引物設(shè)計：參照Arnold Han等[6]，Oligo(dC) adaptor引物序列：5'-ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTAGCAGCAGTTCGATAAGCGGCCGCCATGGACCCCCCCCCCCC(AGT)(ACGT)-3′；Adaptor Primer1序列：5'-ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTA-3′；Adaptor Primer2序列：5′-AGCAGTAGCAGCAGTTCGATAA-3′；TCRVα1first PCR引物：5′-CTGCACGTACCAGACATCTGGGTT-3′；TCRVα1nest PCR引物：5′-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAGGTCGTTTTTCTTCATTCCTTAGTC-3′。

CD8+PD-1+TIL細胞total RNA的提取及cDNA的合成。參照細胞總RNA的提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行CD8+PD-1+TIL細胞total RNA的提取及cDNA第一鏈的合成,應(yīng)用Oligo(dC) adaptor引物進行cDNA第二鏈的合成。TCRVα1CDR3基因的巢式RT-PCR擴增。第一輪PCR：以以上合成的雙鏈cDNA為模板，加入Adaptor Primer1引物及TCRVα1first PCR引物進行第一輪PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 15s,72 ℃ 2 min,共30個循環(huán)。巢式PCR:以以上第一輪PCR擴增的產(chǎn)物為模板，加入Adaptor Primer2引物及TCRVα1nest PCR引物進行巢式PCR擴增，同時擴增GAPDH編碼基因做為質(zhì)控對照。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán)后，72 ℃ 2 min。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織分離培養(yǎng)的TIL細胞的表型鑒定

如圖1～3所示，從肺癌腫瘤組織中分離培養(yǎng)的TIL細胞，CD3+CD8+(CTL)細胞亞群占75.7%(圖1)，CD3+CD4+(Th)細胞亞群占23.1%(圖2)，其中PD-1的表達約為29.7%(圖3)。說明腫瘤組織中浸潤性T淋巴細胞多以CD3+CD8+細胞毒T細胞(CTL)為主要細胞群，但由于其表面高表達PD-1負性調(diào)控分子而致其失去殺傷腫瘤的能力。

2.2 CD8+PD-1+TIL細胞表面TCR CDR3區(qū)基因的擴增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過巢式PCR擴增，CD8+PD-1+TIL細胞擴增出TCR Vα1條帶，約686 bp左右，參照物GAPDH亦顯示出條帶，約158 bp左右。

圖1 TIL細胞中CD3+CD8+細胞分布情況

圖2 TIL細胞中CD3+CD4+細胞分布情況

圖3 TIL細胞中PD-1表達情況分析

注：1為100bp DNA marker;2為空白對照；3為Jurkat T淋巴瘤細胞陽性對照；4為GAPDH質(zhì)控對照；5為CD8+PD-1+TIL細胞。

3 討論

TIL細胞是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)的以淋巴細胞為主的異質(zhì)性淋巴細胞群體,大多聚集在腫瘤周圍或其間質(zhì)呈套狀圍繞癌巢。自1986年Rosenberg等從荷瘤小鼠實體瘤中分離到TIL，并于2002年報道了首例TIL細胞應(yīng)用與黑色素瘤患者的臨床治療效果后[1]，TIL細胞的臨床應(yīng)用越來越廣泛。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，TIL細胞中對腫瘤抗原起特異性免疫反應(yīng)的T細胞克隆主要為CD8+效應(yīng)性T細胞[3],而這群CD8+TIL細胞在腫瘤中由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成記憶性T細胞而逐步演變成功能紊亂的一群細胞[6]，稱之為衰竭性CD8+CTL細胞，這群細胞表面持續(xù)性高表達PD1抑制性受體，其機制可能與腫瘤微環(huán)境中長期高表達PD-L1相關(guān)[7]。我們的研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，從肺癌腫瘤組織中分離培養(yǎng)的TIL細胞主要以CD8+T細胞群為主，約占75.7%，而這群CD8+T細胞PD-1表達率高達29.7%，通過體外殺傷原代培養(yǎng)的肺癌腫瘤細胞能力檢測，發(fā)現(xiàn)這群CD8+PD-1+TIL細胞在體外特異性殺傷活性最強，高于CD8+PD-1-TIL細胞，該結(jié)果與Rosenberg等[2]及Ye等[8]的研究結(jié)果相符，本研究的實驗結(jié)果還顯示未分群的TIL細胞的腫瘤殺傷功能超越了CD8+PD-1-TIL，以上這些實驗結(jié)果尚需要進一步的驗證及機制研究。

T細胞特異性識別腫瘤抗原的分子基礎(chǔ)是其表面TCR受體。近年來，鑒定出功能性T細胞克隆,進而克隆其異二聚體TCR片段，并將其表達于T細胞表面賦予T細胞識別殺傷腫瘤的能力已成為研究熱點。TCR修飾T 細胞(TCR-T)治療腫瘤患者的于2006首次成功應(yīng)用于黑色素瘤患者[9]，之后針對CEA、 NY-ESO-1等腫瘤特異性抗原的TCR-T細胞治療被應(yīng)用于治療多種腫瘤(多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等)，獲得了19%～56% 的臨床反應(yīng)率[10-11]。2015 年，有報道將TIL細胞中分離出腫瘤特異性TCR克隆應(yīng)用于一位膽管癌肝肺轉(zhuǎn)移的患者使其完全緩解[12]。TCRα、β鏈可變V區(qū)基因千變?nèi)f化，但是V區(qū)CDR3才是直接與腫瘤抗原接觸的區(qū)域，CDR3基因可能蘊含著豐富的個體化特異性抗原信息，且優(yōu)勢擴增的原理導(dǎo)致腫瘤抗原特異性TIL細胞亞群中CDR3區(qū)的多樣性較正常人明顯降低，使得通過對CD8+PD-1+TIL細胞亞群CDR3基因測序，尋找差異表達基因，從中獲取個體化腫瘤突變新抗原信息成為可能。但是，由于α/βTCR有32個Vα亞家族基因及26個Vβ亞家族基因，同時擴增難度較大，因此本研究先設(shè)計了Vα1亞家族的引物，利用巢式RT-PCR的方法先摸索TCR Vα1基因體外擴增的條件，為后續(xù)TCR Vα及Vβ全部亞家族CDR3基因的擴增建立穩(wěn)定的實驗條件，為通過對TIL細胞中CDR3基因測序?qū)ふ夷[瘤特異性突變抗原，實現(xiàn)個體化精準細胞免疫治療奠定了前期研究基礎(chǔ)。