王旭，李丹妮，付俁蕭，馮輝

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.鞍山市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧鞍山 114001)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

血清循環(huán)miR-103a-2在非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及意義*

王旭1,2，李丹妮1，付俁蕭1，馮輝1

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.鞍山市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧鞍山 114001)

目的 探討miR-103作為非侵襲性生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)代謝異常的篩查意義。方法 以健康人群和NAFLD患者為研究對(duì)象，采集血清樣本進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。采用NucleoZOL法分離血清miRNA，SYBR Green法對(duì)miR-103a-2進(jìn)行相對(duì)定量分析。Speraman法對(duì)miR-103a-2和生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 血清學(xué)分析結(jié)果顯示，與健康人對(duì)照組相比，NAFLD組TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、ALT(P<0.01)和γ-GGT(P<0.01)水平均明顯升高。與血脂正常NAFLD組相比，高脂血癥NAFLD組中TC(P<0.01)、TG(P<0.01)和LDL-C(P<0.05)水平均明顯升高，與健康人對(duì)照組相比，血脂正常NAFLD患者(P<0.05)和伴有高血脂癥NAFLD患者(P<0.01)血清miR-103a-2表達(dá)水平均升高。血清miR-103a-2水平與血清TC水平呈正相關(guān)(r=0.495，P=0.001)。 結(jié)論 血清miR-103a-2較血脂更為敏感，可能成為NAFLD無(wú)創(chuàng)性篩查指標(biāo)。

非酒精性脂肪肝；高脂血癥；miRNA；miR-103a；熒光實(shí)時(shí)定量PCR

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)可由簡(jiǎn)單的脂肪變性最終進(jìn)展為肝硬化或肝細(xì)胞性肝癌[1]。肝臟活組織檢查雖然是NAFLD診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但其為創(chuàng)傷性診斷而不能在臨床廣泛開展。為此，篩選NAFLD診斷相關(guān)的特異性指標(biāo)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。循環(huán)miRNA已成為多種疾病的候選生物學(xué)標(biāo)志物[2]，特別是作為非侵襲性生物學(xué)標(biāo)志物在肝臟疾病預(yù)測(cè)和診斷中具有特殊價(jià)值。本研究旨在探討NAFLD患者外周血miR-103表達(dá)水平，并與肝臟脂代謝指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，以評(píng)估血清miR-103表達(dá)對(duì)肝臟代謝異常的篩查意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年03月至2016年10月鞍山市中心醫(yī)院就診的NAFLD患者56例，診斷依據(jù)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》[3]，并進(jìn)一步根據(jù)高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)成人血脂異常防治指南_2016年修訂版》[4]將NAFLD組分為血脂正常NAFLD組(n=25，男13例，女12例，年齡36～55歲，中位年齡46.3歲)和高脂血癥NAFLD組(n=31，男15例，女16例，年齡38～68歲，中位年齡53.8歲)。均排除糖尿病、高血壓、腫瘤、慢性系統(tǒng)性疾病及嚴(yán)重腎功能不全。收集同期本院體檢健康者作為健康人對(duì)照組(n=20，男9例，女11例，年齡31～49歲，中位年齡45.3歲)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，各研究對(duì)象知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 NucleoZOL試劑(德國(guó)MN公司)；miDETECTTMmiRNA qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品RNA及Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR(銳博生物公司)；腹部彩色多普勒超聲診斷儀(意大利Esaote公司)；生化分析檢測(cè)儀及配套試劑盒(日本Olympus公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3 標(biāo)本采集 采集各研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取部分血清置于無(wú)RNase/DNase Ep管中，-80 ℃保存。剩余血清2 h內(nèi)完成各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 各生化指標(biāo)檢測(cè) 用生化分析檢測(cè)儀及配套試劑盒檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，NADH法)、堿性磷酸酶(ALP，磷酸對(duì)硝基苯法)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-GGT，速率法)、總蛋白(TP，雙縮脲法)和清蛋白(Alb,溴甲酚綠法)及總膽固醇(TC，酶法)、三酰甘油(TG，磷酸甘油氧化酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C，過氧化氫清除法)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，表面活劑清除法)、葡萄糖(Glu，己糖激酶法)、尿素(Urea，尿素酶法)和肌酐(Cr，肌氨酸氧化酶法)。

1.5 血清miRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 取血清樣本400 μL， 按照NucleoZOL試劑說明書操作提取miRNA。NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照Bulge-LoopTMmiRNA RT-PCR 說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Hsa-miR-103a-2-5p和cel-miR-39外參照引物由銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成。Hsa-miR-103a-2-5p引物序列(MIMAT0009196)：5′-AGCUUCUUUACAGUGCUGCCUUG-3′；cel-miR-39-5p引物序列(MIMAT0020306)：5′-AGCUGAUUUCGUCU

UGGUAAUA-3′，通用下游引物為試劑盒自帶。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括2×SYBR Green Mix 5 μL、50×ROX reference dye Ⅱ0.2 μL、Bulge-LoopTMmiRNA上、下游引物(5 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 1 μL、Rnase-free H2O 3 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。以cel-miR-39為外參照基因，Rnase-free H2O為陰性對(duì)照。用Thermo Scientific 7500軟件采集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析，Hsa-miR-103a-2-5p相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct法計(jì)算。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組間血清學(xué)比較結(jié)果 各組在TC、TG、LDL-C、ALT、γ-GGT、TP和Glu表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較結(jié)果表明，與健康人對(duì)照組相比，NAFLD組TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、ALT(P<0.01)和γ-GGT(P<0.01)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與血脂正常NAFLD組相比，高脂血癥NAFLD組TC(P<0.01)、TG(P<0.01)和LDL-C(P<0.05)表達(dá)水平差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 hsa-miR-103a-2-5p相對(duì)定量分析結(jié)果 與健康人對(duì)照組相比，血脂正常NAFLD患者(t=3.534,P<0.05)和伴有高血脂癥NAFLD患者(t=4.15,P<0.01)血清miR-103a-2表達(dá)水平均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.3 hsa-miR-103a-2-5p表達(dá)與NAFLD患者血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 對(duì)miR-103a-2-5p表達(dá)量分別與TC、TG、HDL-C、LDL-C進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，其與TC(r=0.495，P=0.001)呈正相關(guān)，而與TG(r=0.054，P=0.6425)、與HDL-C(r=0.344，P=0.075)和LDL-C(r=0.331，P=0.07)無(wú)相關(guān)性。

表1 血清生化指標(biāo)水平比較

注：與健康人對(duì)照組相比，#,P<0.05；與NAFLD血脂正常組相比，*,P<0.05。

注：與健康人對(duì)照組相比，#,P<0.05, ##,P<0.01。

圖1 各組miR-103a-2-5p相對(duì)定量表達(dá)水平比較

3 討論

最近一項(xiàng)NAFLD肝組織活檢miRNA表達(dá)譜系研究分析了1 438個(gè)人類miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-103a-2是與NAFLD發(fā)病相關(guān)肝源性miRNA新型候選miRNA之一[5]。而血清miR-103a-2在NAFLD表達(dá)及臨床意義尚不明確。以往的研究顯示，miR-103在糖尿病小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，參與胰島素抵抗[6]；另有學(xué)者認(rèn)為，miR-103在神經(jīng)痛小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，表明其可能參與疼痛的緩解[7]。本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-103a-2在NAFLD組內(nèi)表達(dá)水平升高(P<0.01)。特別是在伴有高血脂癥NAFLD患者中升高更為明顯(P<0.01)。由此提示，血清miR-103a可能參與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。本研究對(duì)血清生化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，與健康人對(duì)照組相比，NAFLD組中TC、TG、ALT和γ-GGT水平表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此表明，肝臟脂肪變性后代謝功能出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致血脂和肝功能出現(xiàn)異常。相關(guān)性分析顯示，血清miR-103a-2-5p與血清TC水平呈正相關(guān)(r=0.49)，進(jìn)而提示血清miR-103a-2可能成為較血脂更為敏感的NAFLD檢測(cè)指標(biāo)，為NAFLD無(wú)創(chuàng)性篩查提供新手段。本研究仍存在不足之處，如收集的病例數(shù)偏少，未對(duì)NAFLD進(jìn)行隨訪資料收集及分析，今后我們將繼續(xù)收集病例，完善資料，并進(jìn)一步分析miR-103a-2-5p與其他血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)用于NAFLD的臨床篩查及診斷。

[1]Lee J, Kim Y, Friso S,etal. Epigenetics in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Mol Aspects Med, 2017, 54:78-88.

[2]焦志軍. 循環(huán)microRNA：潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2012, 30(10):850-856.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組. 非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[J]. 中國(guó)肝臟病雜志(電子版), 2010, 2(4):43-48.

[4]中國(guó)成人血脂異常防治指南修訂聯(lián)合委員會(huì). 中國(guó)成人血脂異常防治指南_2016年修訂版[J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2016, 31(10):937-953.

[5]Soronen J, Yki-Jarvinen H, Zhou Y,etal. Novel hepatic microRNAs upregulated in human nonalcoholic fatty liver disease[J]. Physiol Rep, 2016, 4(1): e12661.

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(本文編輯：許曉蒙)

Expression and clinical significance of circulating miR-103a-2 in serum from patients with nonalcoholic fatty liver disease

WANGXu1,2，LIDan-ni1，F(xiàn)UYu-xiao1，F(xiàn)ENGHui1

(1.DepartmentofImmunology,CollegeofBasicMedicalSciences,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,AnshanCentralHospital,Anshan114001,Liaoning,China)

Objective To investigate the significance of miR-103 as noninvasive biomarker for diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods The serum samples were collected from healthy subjects and NALFD patients to detect biochemical parameters. NucleoZOL method was used to isolate serum miRNA. SYBR Green qPCR was used for relatively quantitative analysis of miR-103a-2. The correlations between miR-103a-2 and biochemical parameters were analyzed by Spearman method. Results Compared with healthy control group, the levels of total cholesterol (TC), triacylglyceride (TG), alanine aminotransferase (ALT) and glutamyl transpeptidase (γ-GGT) were all significantly increased in NAFLD group (P<0.01). Compared with the NAFLD group accompanying ortholiposis, the levels of TC, TG and low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) were all significantly increased in the NAFLD group accompanying dyslipidemia (P<0.01). Compared with the healthy control group, the level of serum miR-103a-2 increased in both NAFLD with ortholiposis group (P<0.05) and NAFLD with dyslipidemia group (P<0.01). The level of serum miR-103a-2 was positively correlated with serum TC (r=0.495,P=0.001). Conclusion Serum miR-103a-2 may be a more sensitive parameter for noninvasive screening of NAFLD than the parameters of blood lipid.

nonalcoholic fatty liver disease; hyperlipemia; miRNA; miR-103a; fluorescent real-time quantitative PCR

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.07

遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長(zhǎng)計(jì)劃(LJQ2014081)。

王旭，1977年生，男，副主任技師，碩士，從事臨床免疫檢驗(yàn)工作。

馮輝，副教授，博士，E-mail：hfeng@cmu.edu.cn。

R446.19

A

2017-03-07)