于冬冬 趙丹陽(yáng) 楊芳 楊鶇祥 楊關(guān)林*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847 2.沈陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110041 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，常規(guī)藥物長(zhǎng)期服用依從性差，新藥價(jià)格昂貴，難以普及[1]。中醫(yī)治療PMOP歷史悠久，更能從整體上把握，從而辨證施治，擁有更廣闊的前景。

PMOP主要是由于雌激素的撤退導(dǎo)致的骨量的減少、骨的脆性增加，其發(fā)病機(jī)制與成骨和破骨的不平衡密切相關(guān)，即成骨細(xì)胞的成骨分化能力減退，破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)[2]。因此，促進(jìn)骨形成的同時(shí)抑制骨吸收仍然是目前防治PMOP的重點(diǎn)所在[3]。

《太平圣惠方》中的鹿角膠丸具有防治骨質(zhì)疏松癥的藥理學(xué)作用[4]。方中鹿角膠平補(bǔ)腎氣，杜仲、牛膝、菟絲子補(bǔ)益腎精，肉桂健補(bǔ)脾胃，滋養(yǎng)后天生化之源，熟地以養(yǎng)血，共起填精益氣之功效，但鹿角膠丸對(duì)PMOP是否具有防治作用目前還沒(méi)有研究。本研究旨在探討鹿角膠丸對(duì)PMOP的防治效果及潛在機(jī)制，為臨床應(yīng)用中藥防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF 級(jí)雌性SD 大鼠80只，3個(gè)月月齡，體質(zhì)量(300±10) g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào) SCXK(遼)2015-0001]。

1.1.2藥物及試劑：(1)實(shí)驗(yàn)藥物。中藥復(fù)方鹿角膠丸均在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院購(gòu)買，組成：由鹿角膠3 g，附子10 g，肉桂5 g，杜仲10 g，山茱萸10 g，菟絲子12 g，熟地黃10 g，肉蓯蓉10 g，五味子5 g，牛膝10 g，巴戟天5 g。將藥制備為水煎劑，生藥量為1 g/mL。仙靈骨葆膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：Z20025337)；福善美(阿侖膦酸鈉，默沙東公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20130241)。(2)實(shí)驗(yàn)試劑。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司，中國(guó))；Human β-CTX ELISA檢測(cè)試劑盒(PHICON Biotech公司，中國(guó))；Human P1NP ELISA檢測(cè)試劑盒(PHICON Biotech公司，中國(guó))；SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德，武漢)；DAB 顯色試劑盒(武漢博士德，武漢)；Runx 2(Abcom，美國(guó))；Cathepsin K(Abcom，美國(guó))。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：Micro CT(比利時(shí)，Bruker SkyScan 1174)；小動(dòng)物輻照儀(美國(guó)，X-RAD 320)；顯微鏡(日本，OLYMPUS)；AMR-100酶標(biāo)儀(中國(guó)，杭州奧盛儀器)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組、造模、給藥：(1)分組。用電子天平先稱量大鼠的體重范圍，按隨機(jī)數(shù)字表法分為8組，各組10只。A組：正常組(Control組)；B組：假手術(shù)組(Sham)；C組：模型空白組(去卵巢組，OVX組)；D組：中藥復(fù)方組：高、中、低3個(gè)劑量組(鹿角膠丸組，LJJW-H、LJJW-M、LJJW-L 組)；E組：中藥對(duì)照組(仙靈骨葆組，XLGB組)；F組：西藥對(duì)照組(福善美組，F(xiàn)SM組)。(2)去卵巢大鼠模型(ovariectomized rat model，OVX)的建立、取血清及骨組織。動(dòng)物的飼養(yǎng)、OVX模型的建立按照課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[5]。末次灌胃后，經(jīng)24 h禁食，將大鼠麻醉成功后，逐步顯露腹主動(dòng)脈及其分叉，緩慢抽吸腹主動(dòng)脈內(nèi)血液注入采血管內(nèi)，離心取上清液，分裝1.5 mL EP管內(nèi)，凍存?zhèn)溆?。剔出雙側(cè)股骨，醫(yī)用紗布包裹，外包錫紙，-70 ℃冰箱凍存，待測(cè)骨密度。(3)給藥劑量與方法。大鼠等效劑量按成人用藥量的6.3倍計(jì)算(成人體質(zhì)量按70 kg計(jì)算)。給藥容積：1 mL/100 g體質(zhì)量。Control、Sham、OVX組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液；中藥復(fù)方組予鹿角膠丸水煎劑；中藥對(duì)照組用仙靈骨葆膠囊水溶液；西藥對(duì)照組用福善美水溶液，調(diào)成1 g/mL的藥物溶液。造模開始后給藥，每日上午、下午各灌胃給藥1次，連續(xù)9周。每周稱大鼠體質(zhì)量1次，根據(jù)其變化調(diào)整給藥劑量。

1.2.2DEXA、Micro-CT、HE染色檢測(cè)骨密度及骨結(jié)構(gòu)：(1)使用DEXA骨密度檢測(cè)儀及系統(tǒng)自帶骨密度分析軟件測(cè)定大鼠的全身、脊柱及下肢的BMD (g/cm2)；(2)將股骨標(biāo)本置于10%福爾馬林中固定24 h 后進(jìn)行micro-CT 掃描。對(duì)所有掃描圖片進(jìn)行3D重建，并使用系統(tǒng)分析軟件計(jì)算松質(zhì)骨的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、結(jié)構(gòu)模式指數(shù)(structural mode index，SMI)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)及BMD(Tb.Sp)[6]；(3)骨組織脫鈣、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木素染色液染色，伊紅復(fù)染，二甲苯透明、中性樹膠封片，常溫晾干，顯微鏡下拍片并保存。

1.2.3ELISA法檢測(cè)骨代謝指標(biāo)：β-CTX、PINP試劑盒，放置恢復(fù)室溫，按照說(shuō)明書進(jìn)行分組加樣，37 ℃溫育箱中避光、緩慢水平均勻搖晃、溫浴60 min，孔內(nèi)均加滿洗滌液，放置30 min后棄掉。加試劑盒內(nèi)A、B液，輕輕搖晃混勻顯色，加入終止液50 μL，終止試劑反應(yīng)。最后測(cè)定吸光度，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出β-CTX、PINP的濃度。

1.2.4骨組織免疫組化、Western Blot測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)：(1)骨組織切片脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉、一抗孵育過(guò)夜、二抗標(biāo)記，DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色，蘇木素復(fù)染、固定封片及檢測(cè)；(2)提取骨組織蛋白、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過(guò)夜、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗孵育、ECL發(fā)光成像，Image J軟件測(cè)定平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用ANOVA方法，若滿足正態(tài)分布，但不滿足方差齊性條件，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠BMD檢測(cè)結(jié)果

雙能X線檢測(cè)各組大鼠的骨密度(圖1 A)，結(jié)果顯示，Control、Sham組的骨密度為(0.25±0.01) g/cm2、(0.26±0.01) g/cm2(Control組圖中未顯示)，OVX組骨密度為(0.18±0.01) g/cm2，鹿角膠丸低劑量組、中劑量組、高劑量組分別是(0.20±0.01) g/cm2、(0.23±0.02) g/cm2、(0.21±0.02) g/cm2(圖中顯示LJJW-M組)，XLGB組為(0.21±0.01) g/cm2，F(xiàn)SM組為(0.22±0.03) g/cm2(圖中未顯示)。相比于Sham組，OVX組大鼠的BMD明顯降低(P<0.05)(圖1B)。相對(duì)于OVX組，LJJW-H、LJJW-M、LJJW-L、XLGB、FSM組的骨密度均有改善，說(shuō)明各個(gè)處理組均有提高絕經(jīng)后大鼠骨密度的藥理學(xué)作用，但作用效果不盡相同，其中以LJJW-M組的骨密度提高最明顯(P<0.05)，其次是FSM組(P<0.05)，LJJW-H和XLGB組的提高骨密度的效果相似，LJJW-L的骨密度改善效果最差，結(jié)果提示鹿角膠丸具有提高去卵巢大鼠BMD的藥效學(xué)作用。

圖1 鹿角膠丸提高OVX大鼠的骨密度Fig.1 Improvement of bone mineral density in OVX rats with deer horn glue pill注：與OVX相比，※P<0.05；與Sham組相比，△P<0.05。

2.2 HE染色結(jié)果

HE染色檢測(cè)各組骨組織結(jié)構(gòu)的改變，Sham組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)完整、無(wú)斷裂，骨小梁形態(tài)排列緊密、所占骨面積的比例大，骨髓腔比例相對(duì)小(圖2)。OVX組骨小梁形態(tài)破壞明顯、出現(xiàn)明顯斷裂，骨小梁排列紊亂，髓腔空洞較多，骨小梁面積百分比(Tb.Ar%)明顯下降(P<0.05，與Sham組比較)。相對(duì)于模型OVX組，LJJW-H、LJJW-M、LJJW-L、XLGB、FSM組骨小梁含量明顯增多、增寬，骨小梁斷裂明顯減少，排列略整齊，髓腔減小。但是仍未有達(dá)到正常組及Sham組的標(biāo)準(zhǔn)。各藥物處理組中以其中LJJW-M組表現(xiàn)尤為明顯(P<0.05，與OVX組比較)。

圖2 HE染色檢測(cè)各組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)的改變Fig.2 HE staining to detect the changes of bone tissue structure in each group注：與OVX相比，※P<0.05；與Sham組相比，△P<0.05。

2.3 大鼠血清β-CTX、PINP含量的改變

2.3.1ELISA法測(cè)定大鼠血清中PINP含量：OVX組血清中PINP含量降低(P<0.05，與Sham組相比)，表明大鼠骨代謝處于骨形成抑制的狀態(tài)(圖3)。LJJW各處理組的PINP值都高于OVX組，尤其以LJJW-M組升高的最明顯(P<0.01，與OVX組相比)。XLGB組亦能升高血清中PINP值(P<0.05，與OVX組相比)。FSM組對(duì)血清中的PINP值影響不明顯。

圖3 中藥復(fù)方鹿角膠丸提高OVX大鼠的PINP值Fig.3 Improvement of PINP value in OVX rats with deer horn glue pill注：與OVX相比，※P<0.05；與Sham組相比，△P<0.05。

2.3.2ELISA法測(cè)定大鼠血清中β-CTX含量：與Sham組相比，OVX組血清中β-CTX含量升高(P<0.05)，LJJW各處理組的β-CTX值都低于Sham組(圖4)。與OVX組相比，P<0.05。

圖4 中藥復(fù)方鹿角膠丸降低OVX大鼠的β-CTX值Fig.4 Reduction of β-CTX in OVX rats with deer horn glue pill注：與OVX相比，※P<0.05；與Sham組相比，△P<0.05。

2.4 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果

Micro-CT檢測(cè)大鼠股骨結(jié)構(gòu)的改變(圖5)。與Sham組相比，OVX組股骨Micro CT 指標(biāo)的BMD、BV/TV和Tb.N分別降低了68.08%、71.89%和61.54%，而SMI上升39. 34%。LJJW-M給藥組明顯改善骨小梁的情況，骨小梁的數(shù)量明顯增多，破壞減少，相對(duì)于模型組來(lái)說(shuō)，XLGB組的骨密度及骨小梁的情況也有所改善，但是改善的幅度及效果不如中藥處理組。與OVX相比，BMD值LJJW-M組P<0.01，XLGB組P<0.05。Tb.N值LJJW-M組P<0.05，XLGB組P<0.05。

圖5 中藥復(fù)方鹿角膠丸改善骨結(jié)構(gòu)Fig.5 Deer horn glue pill improves bone structure注：*：與OVX相比，LJJW-M組P<0.01，XLGB組P<0.05；△：與OVX相比，LJJW-M組P<0.05，XLGB組P<0.05。

2.5 Western blot 檢測(cè)結(jié)果

2.5.1成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx 2的表達(dá)：OVX大鼠予鹿角膠丸中藥復(fù)方(LJJW-M)干預(yù)12周后，OVX組Runx 2的表達(dá)明顯降低(P<0.05，與Sham組相比較)(圖6)，而LJW-M處理組的Runx 2表達(dá)相對(duì)升高(P<0.05，與OVX組相比較)，但是沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組的水平，而XLGB組的Runx 2的表達(dá)與LJJW-M相似(P<0.05，與OVX組相比較)。

圖6 中藥復(fù)方鹿角膠丸促進(jìn)Runx 2蛋白表達(dá)Fig.6 Promotion of the expression of Runx 2 protein with deer horn glue pill注：*：與OVX相比，LJJW-M組P<0.05，XLGB組P<0.05；△：與Sham相比，P<0.05。

2.5.2破骨相關(guān)蛋白Cathepsin K的表達(dá)：OVX大鼠予鹿角膠丸中藥復(fù)方(LJJW-M)干預(yù)12周后，與Sham組相比，OVX組的Cathepsin K表達(dá)明顯升高(P<0.01，與Sham組相比較)(圖7)。而LJW-M處理組的表達(dá)相對(duì)減低(P<0.01，與OVX組相比較)，甚至低于普通的水平，而FSM組的Runx2的表達(dá)與LJJW-M相似(P<0.05，與OVX組相比較)。

圖7 鹿角膠丸抑制Cathepsin K蛋白表達(dá)Fig.7 Prohibition of the expression of Cathepsin K protein with deer horn glue pill注：*：與OVX相比，LJJW-M組P<0.01，XLGB組P<0.05；△：與Sham相比，P<0.01。

2.6 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步檢測(cè)成骨相關(guān)通路蛋白R(shí)unx2的表達(dá)。結(jié)果顯示，對(duì)照組松質(zhì)內(nèi)骨細(xì)胞內(nèi)有一定的Runx 2的蛋白表達(dá)(棕色顆粒，箭頭所示)(圖8)。與Sham組比較，OVX組的Runx 2的蛋白表達(dá)明顯減少，鹿角膠丸中藥復(fù)方(LJJW-M)處理OVX大鼠一定時(shí)間(12周)后，Runx2的表達(dá)相對(duì)增多(P<0.01，與OVX組相比較)，但是沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組的水平，而XLGB組的Runx2的表達(dá)亦增加，但表達(dá)低于LJJW-M處理組(P<0.05，與OVX組相比較)。

圖8 鹿角膠丸促進(jìn)Runx 2蛋白表達(dá)Fig.8 Promotion of the expression of Runx 2 protein with deer horn glue pill注：與OVX相比，*P<0.01；與OVX相比，△P<0.05。

3 討論

PMOP主要是由于雌激素的撤退導(dǎo)致的骨量的減少、骨的脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加的一種疾病，隨著人口的老齡化，該病的發(fā)病率及致殘致死率也在逐年提升[1-2]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載：“腎者，主骨生髓”“腎主藏精”，補(bǔ)腎填精仍是治療PMOP的主要治則。研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用鹿角膠丸對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠干預(yù)的研究中，與對(duì)照組相比較鹿角膠丸能夠明顯增加骨密度，促進(jìn)骨形成，抑制抑制骨吸收[4]。鹿角粉制成的顆粒具有補(bǔ)鈣，溫腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨等功效[7]。

本研究對(duì)鹿角膠丸防治PMOP的藥理學(xué)作用及其潛在機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鹿角膠丸能夠提OVX大鼠骨密度，其中以LJJW-M組的骨密度提高最明顯，結(jié)果提示鹿角膠丸具有提高去卵巢大鼠BMD的藥效學(xué)作用。隨后，應(yīng)用Micro-CT、HE染色檢測(cè)各組骨組織結(jié)構(gòu)的改變，模型組骨小梁形態(tài)破壞明顯、出現(xiàn)明顯斷裂，骨小梁排列紊亂，髓腔空洞較多。LJJW-M處理組骨小梁含量明顯增多、增寬，骨小梁斷裂明顯減少，排列略整齊，髓腔減小，LJJW-M組提高OVX大鼠BMD、BV/TV 和Tb.N，降低SMI值，說(shuō)明鹿角膠丸具有改善骨結(jié)構(gòu)、增加骨強(qiáng)度的藥理學(xué)作用。

PMOP發(fā)生的過(guò)程中，血清中的相關(guān)股形成及骨吸收的檢測(cè)標(biāo)記也隨之發(fā)生改變[8]，LJJW各處理組的β-CTX值都低于Sham組，尤其以LJJW-M組降低的最明顯，說(shuō)明鹿角膠丸能夠降低OVX大鼠血清中β-CTX水平、抑制骨吸收。模型組血清中PINP含量降低，LJJW各處理后PINP升高，說(shuō)明LJJW能夠提高血清中PINP、促進(jìn)骨形成。

Runx 2是骨形成重要的通路調(diào)節(jié)蛋白[9]，OVX組的Runx2表達(dá)明顯降低，而LJW-M處理組的Runx 2表達(dá)相對(duì)升高，但是沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。Cathepsin K是破骨細(xì)胞吸收活性的重要調(diào)節(jié)蛋白[10], Cathepsin K的表達(dá)在OVX組明顯升高，而LJW-M能夠抑制其表達(dá)，甚至低于對(duì)照水平。說(shuō)明鹿角膠丸可能通過(guò)對(duì)成骨及破骨的雙重調(diào)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到防治PMOP的目的。

本研究從動(dòng)物體內(nèi)的角度探討鹿角膠丸對(duì)PMOP的防治效果及潛在的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)鹿角膠丸具有防治PMOP的藥理學(xué)作用的同時(shí)，且可能通過(guò)調(diào)節(jié)成骨及破骨的雙重作用完成的，本研究豐富了中醫(yī)防治PMOP的科學(xué)內(nèi)涵，并為該藥應(yīng)用于臨床防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。