周帥琪 梁龍 于杰 魏戌 馮敏山 王尚全 銀河 尹遜路 陳明* 朱立國(guó)*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 3.中醫(yī)正骨技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是骨的脆性因骨密度降低、骨微觀結(jié)構(gòu)退化而增加的多發(fā)于中老年人的全身性骨代謝疾病，其嚴(yán)重后果為日?；顒?dòng)中骨折危險(xiǎn)性增高，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折[1]。臨床表現(xiàn)以腰酸膝軟、疼痛或全身骨痛為主。OP發(fā)病受年齡、性別、體質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)等多種因素的影響[2]，治療也具有多樣性，中醫(yī)藥以其多成分多靶點(diǎn)多通路的特點(diǎn)，在OP的治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

OP屬于中醫(yī)“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇，參考《中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕免疫病學(xué)》《中醫(yī)診斷學(xué)》和中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥相關(guān)專(zhuān)家共識(shí)，可歸納常見(jiàn)證型為肝腎陰虛證、腎陰陽(yáng)兩虛證、脾腎陽(yáng)虛證、腎虛血瘀證[3-4]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載：“腎生骨髓，髓生肝”。《醫(yī)經(jīng)精義》云：“髓者腎精所生，精足則髓充，髓充者則骨強(qiáng)”。臨床常用獨(dú)活寄生湯進(jìn)行治療，取其補(bǔ)益肝腎、祛濕止痛之效，方中以獨(dú)活和桑寄生為君藥，獨(dú)活，味辛、苦，性微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕，止痛，解表之功效，為治風(fēng)濕痹痛的主藥；桑寄生，味苦、甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨的功效，《本草求真》謂其為補(bǔ)腎補(bǔ)血要?jiǎng)瑑伤幒嫌?，共奏補(bǔ)益肝腎，祛痹止痛之效。然而基礎(chǔ)研究中關(guān)于獨(dú)活寄生湯治療OP的相關(guān)報(bào)道較為少見(jiàn)，其作用機(jī)制也尚未明確，故選取獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)，分析其有效成分、作用靶點(diǎn)及潛在機(jī)制，為其臨床推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步探究獨(dú)活寄生湯治療OP的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合多學(xué)科知識(shí)和方法，具有系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)。中藥深入研究的過(guò)程，常因藥物成分多、靶點(diǎn)及作用途徑復(fù)雜，致使研究較為困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的優(yōu)勢(shì)為研究中藥提供了新的方向，可從整體角度系統(tǒng)分析藥物對(duì)疾病的干預(yù)和影響，揭示中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制[5]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從分子水平探索獨(dú)活-桑寄生治療OP的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究和臨床推廣應(yīng)用提供參考。

1 數(shù)據(jù)獲取和處理

1.1 中藥成分及靶點(diǎn)篩選

本研究首先在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中輸入中藥名稱(chēng)“獨(dú)活”“桑寄生”為檢索詞獲取兩種藥物的化學(xué)成分，并通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)進(jìn)行補(bǔ)充，將滿(mǎn)足篩選條件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug likeness，DL)≥0.18的結(jié)果保留即為獨(dú)活和桑寄生的有效成分。將所得的有效成分通過(guò)SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.symmap.org)獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)篩選物種為“homo sapiens”的靶點(diǎn)，即獨(dú)活-桑寄生主要成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。綜合可得到藥物-成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)。

1.2 OP相關(guān)靶點(diǎn)搜集

以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)檢索與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)。

1.3 中藥作用疾病的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將上述獲得的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入OmicShare云平臺(tái)(http://www.omicshare. com)維恩圖模塊進(jìn)行映射，篩選出獨(dú)活-桑寄生與OP的共標(biāo)靶點(diǎn)，此共標(biāo)靶點(diǎn)即為本研究中藥治療疾病的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape3.6.0軟件中“Network Analyze”分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)功能，將篩選得到的獨(dú)活-桑寄生治療OP的潛在作用靶點(diǎn)和2.1中藥物-成分-靶點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件，并分析得到網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選核心成分和靶點(diǎn)。

1.5 GO富集分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得獨(dú)活-桑寄生治療OP潛在靶點(diǎn)的Gene ID，并將此數(shù)據(jù)通過(guò)Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ensembl.org/index.html)轉(zhuǎn)化為Ensembl Gene ID。在OmicShare云平臺(tái)動(dòng)態(tài)GO富集分析模塊進(jìn)行分析，將輸出結(jié)果滿(mǎn)足限定條件P<0.01，F(xiàn)DR<0.01的進(jìn)行保留，并按照P值從小到大排序，選取前20個(gè)GO條目繪制成高級(jí)氣泡圖。

1.6 KEGG 通路富集分析

通過(guò)DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov)對(duì)獨(dú)活-桑寄生治療Osteoporosis的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，將輸出結(jié)果滿(mǎn)足限定條件P<0.01，F(xiàn)DR<0.01的進(jìn)行保留，刪除其中疾病相關(guān)信號(hào)通路后按照P值從小到大排序，選取前10條在OmicShare云平臺(tái)高級(jí)氣泡圖模塊繪制成圖。

2 結(jié)果

2.1 中藥作用疾病的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到獨(dú)活化合物96個(gè)，桑寄生化合物9個(gè)，限定條件下篩選出兩味中藥活性化合物共41個(gè)，共預(yù)測(cè)靶標(biāo)355個(gè)。同時(shí)將檢索得到的4 091個(gè)OP相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行維恩圖映射，并取交集，得到138個(gè)中藥治療疾病的潛在作用靶點(diǎn)，見(jiàn)如圖1。潛在靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)活性成分共39個(gè)，其所在藥物和相應(yīng)的潛在靶點(diǎn)如表1所示。

圖1 獨(dú)活-桑寄生和OP的靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Target Venn diagram of angelica pubescens radix-loranthaceae and OP

2.2 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析結(jié)果中參數(shù)節(jié)點(diǎn)連接度(degree)和介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)的數(shù)值可表示其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。本研究篩選節(jié)點(diǎn)連接度>均值(7.667)且介數(shù)中心性>均值(0.031)的核心成分共3個(gè)，分別為Quercetin(槲皮素)、Osthol(蛇床子素)、Psoralen(補(bǔ)骨脂素)；篩選節(jié)點(diǎn)連接度>均值(1.884)且介數(shù)中心性>均值(0.003)的核心靶點(diǎn)共24個(gè)，具體信息如表2所示。其中前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1(PTGS1)、雌激素受體α(ESR1)、β-2腎上腺素能受體(ADRB2)的關(guān)鍵參數(shù)較其他潛在靶點(diǎn)更高，可能為獨(dú)活-桑寄生治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)如圖2，共有179個(gè)節(jié)點(diǎn)、299條線(xiàn)，其中黃色菱形代表中藥，藍(lán)色正方形代表潛在靶點(diǎn)，綠色圓形代表獨(dú)活-桑寄生的活性成分，節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)連接度成正比。

圖2 獨(dú)活-桑寄生治療OP的中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Traditional Chinese medicine-active ingredients-potential target network of angelica pubescens radix-loranthaceae for OP therapy

表1 獨(dú)活-桑寄生治療OP的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)Table 1 Active components and corresponding targets of angelica pubescens radix-loranthaceae therapy for OP

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集

GO富集分析結(jié)果以P<0.01，F(xiàn)DR<0.01為篩選條件，可得到生物過(guò)程(biological process，BP)2 509條，包括對(duì)含氧化合物的反應(yīng)(response to oxygen-containing compound)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)(response to organic substance)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)(cellular response to chemical stimulus)等；分子功能(molecular function，MF)193條，包括對(duì)酶結(jié)合(enzyme binding)、同一蛋白結(jié)合(identical protein binding)、信號(hào)受體結(jié)合(signaling receptor binding)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)等；細(xì)胞組成(cell composition，CC)113條，包括膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等。GO富集結(jié)果制作的高級(jí)氣泡圖中氣泡越大代表富集在該條目上的基因個(gè)數(shù)越多；氣泡的顏色越紅，表示該條目的P值越小(見(jiàn)圖3～5)。KEGG通路富集篩選可得到12條KEGG 通路富集結(jié)果，包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、低氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。選取前10條繪制成高級(jí)氣泡圖(見(jiàn)圖6)。

圖3 獨(dú)活-桑寄生治療OP GO生物過(guò)程富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO BP enrichment in the treatment of osteoporosis with angelica pubescens radix-loranthaceae

圖4 獨(dú)活-桑寄生治療OP GO分子功能富集氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO MF enrichment in the treatment of OP with angelica pubescens radix-loranthaceae

圖5 獨(dú)活-桑寄生治療OP GO細(xì)胞組成富集氣泡圖Fig.5 Bubble chart of GO CC enrichment in the treatment of OP with angelica pubescens radix-loranthaceae

圖6 獨(dú)活-桑寄生治療OP KEGG通路富集的氣泡圖Fig.6 Bubble chart of enrichment of KEGG pathway in the treatment of OP with angelica pubescens radix-loranthaceae

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與體內(nèi)成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨溶解、骨吸收間動(dòng)態(tài)平衡的破壞密切相關(guān)[6-7]。研究表明，炎癥是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的直接因素[8]，NF-κB 和JNK的激活，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞的增殖分化能力[9-10]；TNF-α也可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，其途徑是通過(guò)刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞[11]。氧化應(yīng)激也可打破成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生。Li等[12]使用地塞米松處理成骨前體細(xì)胞 MC3T3-E 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中 ROS 水平和成骨細(xì)胞的凋亡率均顯著升高，繼而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

3.1 核心成分和OP

本研究篩選出核心成分為槲皮素、蛇床子素和補(bǔ)骨脂素。槲皮素是一種多羥基黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，研究表明[13-14]槲皮素可通過(guò)提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能、影響細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，達(dá)到抗炎的作用。也有研究表明，槲皮素還可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、清除ROS，達(dá)到減輕氧化應(yīng)激損傷的作用[15-16]。機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激之間存在相互作用，相互影響，槲皮素對(duì)其均具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而緩解骨質(zhì)疏松的發(fā)展。鄭紅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)升高骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而緩解OP。郝芳卉等[18]、張宇等[19]實(shí)驗(yàn)研究表明蛇床子素可通過(guò)抑制TNF-α和TLR4/NF-κB 通路的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)。蛇床子素也可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的表達(dá)，達(dá)到下調(diào)活化T細(xì)胞核因子(NFATc1)等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化成熟；同時(shí)可通過(guò)作用于Wnt/β-catenin、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[20-21]。補(bǔ)骨脂素具有抗炎和抗氧化的作用，研究表明，補(bǔ)骨脂素能顯著抑制hPDLCs炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[22-23]。黃奎等[24-25]通過(guò)檢測(cè)小鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài)下血清I型膠原羧基末端肽水平和股骨生物力學(xué)性能，提示補(bǔ)骨脂素可抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)化率。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)和OP

本研究篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括PTGS2、PTGS1、ESR1、ADRB2等。PTGS2和PTGS1分別為PTGS的兩種同工酶，具有抗炎和抗氧化的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)[26]，PTGS2參與各種炎性毛細(xì)血管后微靜脈的通透性、白細(xì)胞的趨化作用、T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。湯雁利等[27]研究發(fā)現(xiàn)康復(fù)新可通過(guò)降低PTGS2的表達(dá)，在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起到抗炎作用。PTGS1在炎癥、關(guān)節(jié)炎疾病和癌癥的病理生理進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[28]。研究表明，藥物抑制或基因沉默PTGS1的表達(dá)可降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能通過(guò)負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路起作用[29-30]。ESR1是雌激素受體(ESR)中的一種，存在于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中，雌激素通過(guò)與ESR1結(jié)合發(fā)揮作用。Fatima等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在ESR1敲除雌性小鼠的腹股溝和性腺白色脂肪組織中，促炎細(xì)胞因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)[32-33]的表達(dá)降低，提示E2 / ESR1在增強(qiáng)血管生成，減少炎癥等功能中具有重要意義。ADRB2表達(dá)的β2腎上腺素受體(β2-AR)廣泛存在于免疫細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，在人和鼠的樹(shù)突狀細(xì)胞中，刺激 β2-AR 能夠激活 NOD2 信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn) T 細(xì)胞分化，并調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和炎癥反應(yīng)[34]。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可預(yù)測(cè)得到獨(dú)活-桑寄生中有效成分槲皮素、蛇床子素和補(bǔ)骨脂素等，通過(guò)作用于PTGS2、PTGS1、ESR1、ADRB2等靶點(diǎn)，從而影響含氧化合物的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)等生物過(guò)程和腫瘤壞死因子、低氧誘導(dǎo)因子-1、PI3K-Akt等信號(hào)通路，達(dá)到抗炎和抗氧化的作用，進(jìn)而治療OP。后期可通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，完善基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)，為明晰其作用機(jī)制和藥物的推廣應(yīng)用提供更高等級(jí)的循證證據(jù)。