胡 濤，周曉蕓 ，薛 丹 ，張麗華

（1.廣州市第一人民醫(yī)院，廣州 510180；2.廣州醫(yī)科大學，廣州 511436）

香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒長期作用于肺部是慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的發(fā)病機制之一，有害氣體可刺激細胞釋放大量活性氧（ROS），從而引起氧化/抗氧化失衡，加速COPD的進展，最終發(fā)展成為呼吸衰竭，具有較高的病死率，而骨骼肌能量代謝不足是呼吸衰竭的直接原因，目前臨床上面臨著治療挑戰(zhàn)。呼吸肌大部分屬于骨骼肌，對能量有著較高的需求和敏感性，而線粒體是“能量加工廠”，如果其結構或功能損傷可直接導致骨骼肌供能不足。中醫(yī)學認為COPD晚期的呼吸衰竭屬于“喘證、氣脫”等范疇，其關鍵病機是“脾虛（痰）濕盛”。參苓白術散為培土生金的代表方，具有益氣健脾，祛濕化痰功效。臨床研究[1-2]發(fā)現參苓白術散可提高COPD患者運動耐力，減輕氧化損傷，但其相關作用機制目前尚不明確。故本實驗通過參苓白術散干予COPD小鼠模型，檢測腓腸肌組織三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和 一磷酸腺苷（AMP）及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）、線粒體融合蛋白2（Mfn2）指標變化，探討培土生金法對COPD小鼠骨骼肌線粒體能量代謝的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8周齡健康雄性SD小鼠50只（20±2）g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2018-0094，本實驗得到廣東省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物的配制 參苓白術散（蓮子10 g，炒薏苡仁 10 g，砂仁 10 g，桔梗 10 g，炒白扁豆 15 g，茯苓20 g，黨參 20 g，炙甘草 20 g，白術 20 g，山藥 20 g），購自廣州市第一人民醫(yī)院中藥房，經廣州中醫(yī)藥大學中藥中心鑒定合格，用回流提取法將藥液濃縮至相當于藥液含2.25 g/mL生藥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗藥品與試劑 大前門牌過濾嘴香煙（20 支/包，煙堿含量 0.8 mg，焦油量 11 mg/支，一氧化碳含量13 mg/支，上海煙草集團有限責任公司出品）；考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）；RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供；兔抗小鼠AMPK、p-AMPK一抗（美國Cell Signaling Technology公司），兔抗小鼠PGC-1α一抗（美國Novus Biological公司），兔抗小鼠Mfn2單抗（英國Abcam公司）、β-actin單抗、山羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.4 實驗儀器 自制熏煙染毒箱：70cm×50cm×40cm，145 L，每側各有1.5 cm×1.5 cm小孔；ODSHYPERSIL C18色譜柱（Thermo）；1260 高效液相色譜儀（Agilent）；NanoDrop 2000C超微量紫外/可見分光光度計（Thermo）；恒溫水浴槽（上海安寧醫(yī)療器械廠）；低溫臺式高速離心機（中國上海TLG16G）；電泳及轉膜裝置（美國Bio-RAD公司）。

1.5 COPD模型復制及藥物干預 小鼠在SPF級動物實驗室適應性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機法將50只小鼠分為5組，分別為對照組（Control）、模型組（Model）、參苓白術散高、中、低劑量組（SL-H、SLM、SL-L），參照宋一平等[3]的方法制作小鼠COPD模型。除對照組小鼠，所有小鼠置入自制熏煙染毒箱，每天2批次予以被動吸煙，每批次8支大前門香煙，分兩次給予，每次持續(xù)30 min，2次熏煙間隔時間大于4 h，持續(xù)8周。熏煙完畢將動物放回原飼養(yǎng)籠中正常進食進水。熏煙4周后，在熏煙前給予藥物干預（SL-H、SL-M和SL-L分別按20、10、5 g/kg灌胃），對照組及模型組予生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 生存狀態(tài) 每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、呼吸、攝食量、大便性狀及體質量變化等。

1.6.2 腓腸肌ATP、AMP及ADP含量檢測 精準稱取各組小鼠腓腸肌，置于冰上，制樣、檢測組織中ATP、AMP、ADP 含量[4]。

1.6.3 Western blotting法測定蛋白 AMPK、p-AMPK、PGC-1α及Mfn2 稱取各組肌肉組織，按照1 mg∶7.5 μL的比例將肌肉組織與RIPA裂解液混合置于冰上，用玻璃勻漿器進行研磨并裂解40 min，低溫離心機上離心半徑105 mm，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度后將樣本保存于-20℃冰箱。利用Western blot檢測各組小鼠腓腸肌組織 AMPK（1∶500）、p-AMPK（1∶500）、PGC1-α（1∶800）的表達變化，用試劑化學發(fā)光法顯色條帶，采用Sigma Scan Pro軟件進行數據分析，以β-actin作為內參標記各組蛋白表達水平，其中AMPK磷酸化程度則用pAMPK/AMPK比值表示。每組蛋白重復測量3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 實驗數據采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組小鼠生存狀態(tài)變化情況 各組小鼠熏煙時均喜聚集，多有流涎、點頭呼吸、喘促等癥狀，其中模型組喘促癥狀呈進行性加重，并伴有口鼻分泌物增多，喉中痰鳴，消瘦，大便稀軟，飲食及攝水量減少等。與對照組相比，各組小鼠體質量均增長緩慢，尤以模型組明顯，熏煙結束時體質量和前后差值體質量均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而藥物干預組上述癥狀較模型組有所改善，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小鼠體質量變化，見圖1。

2.2 參苓白術散對各組小鼠ATP/AMP和ADP/ATP的影響 與對照組比較，模型組ATP/AMP降低（P＜0.05）；ADP/ATP 無明顯趨勢，提示模型組小鼠腓腸肌存在著能量代謝障礙；與模型組相比，參苓白術散高劑量組 ATP/AMP 升高（P＜0.05），ADP/ATP無明顯趨勢，表明高劑量參苓白術散可改善骨骼肌能量不足狀態(tài)。見圖2。

2.3 參苓白術散對各組小鼠AMPK磷酸化水平與PGC-1α的影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠腓腸肌組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α 均下降（P＜0.05），提示腓腸肌組織磷酸化水平、調控能量代謝功能下降，而參苓白術散藥物干預后，肌肉組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α均增加（P＜0.05），提示參苓白術散可增加骨骼肌組織內的p-AMPK水平，誘導PGC-1α的表達，改善能量代謝，且存在著劑量效應，見圖3。

圖1 各組小鼠體質量變化情況Fig.1 Changes in body weight of mice in each group

2.4 參苓白術散對各組小鼠Mfn2蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠腓腸肌組織內Mfn2表達降低（P＜0.05），提示腓腸肌組織線粒體穩(wěn)態(tài)被破壞，能量代謝障礙，而參苓白術散藥物干預后，高劑量組Mfn2表達水平較模型組升高（P＜0.05），提示參苓白術散在線粒體層面保護COPD小鼠腓腸肌能量代謝，見圖4。

3 討論

中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為“脾主肌肉，脾胃為氣血生化之源”，而宗氣是治療呼吸肌疲勞不可或缺的重要因素[5]，故健脾益氣（培土生金）可能為治療COPD骨骼肌疲勞的治則之一。相關研究表明[6-8]，健脾益氣中藥及健脾治則可改善動物骨骼肌疲勞，調控線粒體能量代謝。葡萄糖是機體內重要的能量物質，是維持機體活動的“原動力”，它主要是通過三羧酸循環(huán)等氧化分解代謝過程釋放ATP，而ATP可代謝為 ADP 和 AMP，ATP 含量、ADP/ATP、ATP/AMP[9-11]均與葡萄糖代謝相關。ATP/AMP反應的細胞內的能量變化，與AMPK的激活存在著關聯[12]，激活后的AMPK，一方面抑制消耗ATP的分解活動，另一方面通過線粒體生物合成等促進ATP的產生，從而恢復能量平衡[13]。本實驗研究發(fā)現，COPD模型組ATP/AMP比值降低（P＜0.05），提示腓腸肌能量存在著不足，可直接影響其功能狀態(tài)，而參苓白術散高劑量干預后，ATP/AMP 比值升高（P＜0.05），提示參苓白術散可改善COPD小鼠骨骼肌的能量供應，進而維持其正常發(fā)揮功能作用。

圖2 各組小鼠ATP/AMP和ADP/ATP的變化Fig.2 Changes in ATP/AMP and ADP/ATP of mice in each group

圖3 Western blot檢測參苓白術散對腓腸肌組織內AMPK磷酸化水平、PGC-1α的影響Fig.3 Effect of Shenling Baizhu Powder on AMPK phosphorylation level and PGC-1α in gastrocnemius muscle tissue detected by Western blot

圖4 Western blot檢測參苓白術散對腓腸肌組織內Mfn2表達水平的影響Fig.4 Effect of Shenling Baizhu Powder on the expression level of Mfn2 in gastrocnemius muscle tissue detected by Western blot

AMPK是機體內重要的調控因子，可感受細胞內能量變化，被激活后可進而調控下游各種蛋白激酶或基因表達，從而調控機體能量代謝。在線粒體保護方面，AMPK可首先激活PGC-1α，后者是促進線粒體生物合成的主要調節(jié)因子，在調節(jié)線粒體含量方面占有非常大的比重，可調節(jié)線粒體的數量和質量，調控能量合成，參與脂肪酸氧化過程，防止氧化應激損傷[14-17]。本實驗研究結果表明，與對照組比較，模型組小鼠腓腸肌組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α 均下降（P＜0.05），提示腓腸肌組織磷酸化水平、調控能量代謝功能下降，而參苓白術散藥物干預后，肌肉組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α增加（P＜0.05），提示參苓白術散可通過磷酸化AMPK改善COPD小鼠腓腸肌能量代謝障礙，此過程伴隨著PGC-1α表達的上調，表明參苓白術散可通過AMPKPGC-1α保護COPD小鼠骨骼肌功能狀態(tài)。

Mfn2是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關鍵蛋白[18-19]，它處于線粒體外膜和肌漿網之間，主要介導線粒體之間的融合，從而促進物質交換。PGC-1α與雌激素相關受體共同調控著Mfn2[20-22]，PGC-1α表達下降及其本身乙?；揎椇?，Mfn2表達下調，線粒體穩(wěn)態(tài)被破壞[23]，而導致能量產生障礙。本研究發(fā)現，模型組小鼠的Mfn2表達較對照組降低（P＜0.05），而參苓白術散干預后，Mfn2表達較模型組升高（P＜0.05），提示參苓白術散在線粒體層面影響到COPD小鼠腓腸肌能量代謝。

綜合本實驗結果，參苓白術散可能通過激活AMPK-PGC-1α-Mfn2參與保護COPD小鼠骨骼肌功線粒體生物合成及功能狀態(tài)，可提高p-AMPK、PGC-1α、Mfn2的表達，促進線粒體生物合成，進而增加ATP的生成。綜上所述，培土生金法（參苓白術散）在一定程度上可改善COPD小鼠骨骼肌能量代謝重構，從而起到保護COPD小鼠骨骼肌功能的作用。