蔡甜甜, 吳蕾, 陳瑞鳳, 杜秋伶, 范龍, 王奇, 林琳, 于旭華△

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院呼吸科(廣東廣州 510030); 2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸健康研究院呼吸疾病國家重點實驗室/國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(廣東廣州 510180); 3廣州中醫(yī)藥大學(xué) (廣東廣州 510006)

吸煙是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)生的重要原因，而呼吸道病毒感染是誘發(fā)COPD急性加重的重要因素[1]。病毒感染的免疫應(yīng)答是宿主自我保護(hù)的基本防線。目前國內(nèi)對香煙暴露聯(lián)合流感病毒感染的研究報道較少。因此，2018年8月至2020年5月，本研究通過通過短期香煙煙霧暴露及氣道流感病毒滴注的方法，觀察攻毒后7 d內(nèi)小鼠氣道灌洗液免疫細(xì)胞分類計數(shù)、免疫細(xì)胞氧化應(yīng)激能力以及灌洗液蛋白濃度的變化，為后續(xù)研究提供實驗基礎(chǔ)。由于呼吸道病毒感染是導(dǎo)致COPD由穩(wěn)定期向急性期過度的特殊病理階段，因此本研究一方面旨在明確吸煙對呼吸道病毒感染后宿主免疫應(yīng)答的影響，另一方面也探討呼吸道病毒感染在誘發(fā)COPD急性加重過程中的免疫病理改變，為研發(fā)針對本階段預(yù)防COPD急性加重的藥物提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 大前門過濾嘴香煙(煙堿含量 0.8 mg，焦油量11 mg /支，上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司出品)。毒株為H1N1(A/PR/8/34)流感病毒鼠肺適應(yīng)株(MEM溶媒)，由廣州市呼吸健康研究院提供，于-80℃低溫保存。Kwik-Diff(Thermo Fisher Scientific，No.9990700)，Acridine Orange hydrochloride Solution(Sigma, No.8097-10ML)，Ethidium bromide(Sigma, No.E1510-10ML)，TRIzol? Reagent(life technologies， No.15596026)。PDB(2-丁酸佛波醇酯；Sigma aldrich，No.P1269)和L-012(8-氨基-5-氯-7-苯基-2，3-二氫吡啶并[3，4-d]噠嗪-1，4-二酮；Wako Pure ChemicalIndustries，No.120-04891)，BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific，No.UH289368)。

1.2 儀器 多功能臺式冷凍離心肌(Allegra X-22R)，顯微鏡(BX61+DP720,Olympus)，酶標(biāo)儀(Tacan)。

1.3 實驗動物 由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司購置6～8 周齡雌性SPF級Balb/c小鼠，動物許可證號：NoSCXK(京)2016-0002，所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始進(jìn)行實驗。

1.4 動物的分組及造模

1.4.1 動物分組 選取SPF級雌性Balb/c小鼠，隨機(jī)分成7組：分別為假熏煙假攻毒組，假熏煙攻毒組(6PFU)，假熏煙攻毒組(12PFU)，假熏煙攻毒組(24PFU)，熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU)，熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)，以及熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)。

1.4.2 熏煙方法 熏煙方法參考本課題組前期熏煙方法[2-3]，小鼠置于18 L熏煙箱中進(jìn)行熏煙，以6 mL/s的速度抽取香煙煙霧至60 mL注射器，隨即將煙霧注入熏煙箱中。每天3次予以被動吸煙，于9am、12am、3pm進(jìn)行，每次3支大前門香煙(20支/包，煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，一氧化碳含量13 mg/支)，每次持續(xù)1 h，連續(xù)4 d后進(jìn)行后續(xù)實驗。假熏煙小鼠放入另一干凈且相同大小的塑料箱內(nèi)，不做熏煙處理，其余操作同熏煙組小鼠。

1.4.3 攻毒方法 小鼠進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，于第5天進(jìn)行攻毒。用1 mL注射器共抽取2 mL異氟烷均勻灑在麻醉瓶中，隨后將小鼠置于麻醉瓶中旋緊瓶蓋，待小鼠出現(xiàn)深快呼吸后取出，迅速向小鼠鼻內(nèi)滴注PR8病毒30 μL/只。假攻毒組鼻內(nèi)滴注MEM培養(yǎng)基 30 μL/只，其余操作同攻毒組小鼠。分別觀察攻毒后3、5、7 d小鼠變化。

1.5 樣本制備 小鼠用4%戊巴比妥鈉腹腔注射安樂死，切開氣管處皮毛，充分暴露氣管，插入氣管灌洗管(剪成楔形的24 G靜脈留置針)，分4次抽取0.4、0.3、0.3、0.3 mL的PBS并回抽(共約1 mL)，用于細(xì)胞計數(shù)，分類計數(shù)及蛋白含量檢測。

1.6 檢測內(nèi)容

1.6.1 小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞分類計數(shù)的測定 將氣道灌洗液混勻，加入20 μL AO/EB工作液混勻，將細(xì)胞計數(shù)板置于熒光顯微鏡下進(jìn)行有核細(xì)胞計數(shù)，剩余灌洗液進(jìn)行涂片離心，Kwik-Diff染色。通過形態(tài)區(qū)分進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)。

1.6.2 小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞ROS產(chǎn)生速率的檢測 選用不透光的黑色96孔板，每孔加入50 μL細(xì)胞混懸液、150 μL L-O12工作液和20 μL PDB工作液。檢測前加入20 μL PDB進(jìn)行刺激。之后立即選擇Luminescence功能進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm，每孔測定1 s，共30個循環(huán)，間隔45 s。通過50 μL細(xì)胞懸液的細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞密度計算ROS的產(chǎn)生速率，用相對光單位(RLU)表示。

1.6.3 小鼠支氣管灌洗液蛋白濃度測定 運用BCA蛋白定量試劑盒檢測各灌洗液中的蛋白含量，用酶標(biāo)儀檢測562 nm波長下的吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各個樣品的蛋白濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用prism7.0統(tǒng)計軟件，多組比較采用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，進(jìn)一步兩兩比較，采用Tukey檢驗。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熏煙聯(lián)合病毒感染對小鼠灌洗液中細(xì)胞計數(shù)的影響 攻毒3 d后，與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)、中性粒細(xì)胞計數(shù)(P<0.05)和淋巴細(xì)胞計數(shù)(P<0.05)均明顯升高，熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU)和熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計數(shù)明顯增多(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)、淋巴細(xì)胞計數(shù)(P<0.05)明顯增多。見表1。

表1 攻毒3d后氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù)

攻毒5 d后，與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計數(shù)明顯增多(P<0.05)，假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.05)和巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.05)明顯增多，熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU)小鼠氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計數(shù)明顯增多(P<0.05)，熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)明顯增多，熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)、中性粒細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)和淋巴細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)明顯增多。并且與假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠相比，熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)和中性粒細(xì)胞總數(shù)明顯增多(P<0.05)。見表2。

表2 攻毒5 d后氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù)

攻毒7 d后，與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)和中性粒細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)明顯增多，假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)和巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)明顯增多；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)明顯增多。與熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)相比，假熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.05)、巨噬細(xì)胞計數(shù)(P<0.05)和中性粒細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)明顯增多。見表3。

表3 攻毒7 d后氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù)

2.2 熏煙聯(lián)合病毒感染對小鼠氣道灌洗液細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(24PFU)在病毒感染3 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.05)，假熏煙攻毒組(12PFU)在病毒感染7 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)在病毒感染5 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.01)。與假熏煙攻毒組(24PFU)相比，熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)在病毒感染5 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.05)；與熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)相比，假熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)在病毒感染7 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.01)。見表4。

表4 ROS的產(chǎn)生 (1 000個細(xì)胞·s)

2.3 熏煙聯(lián)合病毒感染對小鼠灌洗液蛋白濃度的影響 與假熏煙假攻毒組相比，在病毒感染3 d后，假熏煙攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)。

在病毒感染5 d后，假熏煙攻毒組 (6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)。

在病毒感染7 d后，假熏煙攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.05,P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)。見表5。

表5 灌洗液蛋白濃度表達(dá)量

3 討論

本研究主要是觀察香煙煙霧短期(4 d)暴露對流感病毒感染小鼠氣道灌洗液免疫細(xì)胞數(shù)量，產(chǎn)生ROS的能力以及灌洗液蛋白濃度的影響。研究中的香煙煙霧的產(chǎn)生方法，模擬人類吸煙的頻率和速度，并且造成和人類吸煙者相似的CoHb水平，從而說明此種暴露方式下的小鼠香煙暴露程度和人類具有相似的水平[4]。不同于以往病毒性肺炎所需的病毒誘導(dǎo)滴度，COPD中病毒感染盡管可誘導(dǎo)一定程度的氣道炎癥，但可能并沒有造成嚴(yán)重的肺損傷。因此本實驗選用了較低的病毒滴度進(jìn)行感染[5-6]。

病毒作為病原體入侵氣道上皮細(xì)胞，氣道上皮細(xì)胞可表達(dá)多種模式識別分子以識別病原體，從而激活信號通路并釋放抗病毒物質(zhì)及炎癥因子，同時又會迅速募集附近免疫細(xì)胞到達(dá)受損、感染部位，對病原體進(jìn)行殺傷和清除快速引起機(jī)體免疫反應(yīng)[7-8]。研究表明，H1N1流感毒株感染導(dǎo)致假熏煙小鼠和熏煙小鼠氣道細(xì)胞總數(shù)及分類計數(shù)在感染初期(第3天)呈滴度依賴性升高。然而，24PFU H1N1流感病毒在假熏煙小鼠氣道內(nèi)誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞的總數(shù)和分類計數(shù)略高于熏煙小鼠(P>0.05)。隨著感染時間的推移，盡管24PFU H1N1流感病毒導(dǎo)致假熏煙小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)逐漸升高，但與第3天相比，第7天小鼠氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量下降，而巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明氣道炎癥逐漸由急性期向慢性期恢復(fù)期過度。然而在熏煙小鼠體內(nèi)，流感病毒(24PFU)感染后第5天細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)達(dá)到高峰，且峰值水平與假熏煙小鼠第3天水平相似。流感病毒(12PFU)感染后第7天，假熏煙小鼠氣道細(xì)胞總數(shù)達(dá)到峰值，而熏煙小鼠氣道數(shù)量則維持在相對較低水平， 說明熏煙導(dǎo)致氣道免疫細(xì)胞募集的延遲， 因此香煙暴露可能導(dǎo)致宿主抗病毒防御功能的異常。與本研究相似，Hsu等[5]研究表明，香煙暴露降低了機(jī)體對流感病毒感染的應(yīng)答，如γ干擾素、腫瘤壞死因子-α、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子的分泌。Wu 等[9]研究表明，吸煙者的氣道上皮細(xì)胞抗病毒應(yīng)答受損。另一方面，有研究表明，香煙煙霧直接通過影響病毒的復(fù)制從而限制了病毒復(fù)制的程度[10]，因此病毒在體內(nèi)復(fù)制異常也可能是香煙暴露導(dǎo)致氣道免疫細(xì)胞數(shù)量變化的原因。

ROS作為活性氧物質(zhì)具有強(qiáng)氧化作用，因而是吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)殺死入侵微生物的主要武器，因此免疫細(xì)胞應(yīng)激能力的下降或反應(yīng)延遲可能會增加繼發(fā)細(xì)菌等微生物感染的可能性[11]。對慢性肉芽腫疾病患者研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)體內(nèi)活性氧生成活力低下，白細(xì)胞不能有效地引起呼吸爆發(fā)從而使這類患者易受真菌等微生物的感染而威脅生命[12]?？梢娪赏淌杉?xì)胞所產(chǎn)生的ROS是宿主防御入侵病原體所必需的。本次研究表明, 氣道免疫細(xì)胞ROS的產(chǎn)生速率的變化與氣道灌洗液細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢一致。即流感病毒(24PFU)導(dǎo)致假熏煙小鼠氣道免疫細(xì)胞ROS產(chǎn)生速率高峰在第3天， 而熏煙小鼠氣道免疫細(xì)胞ROS產(chǎn)生速率高峰在第5天。說明香煙暴露延遲氣道免疫細(xì)胞的功能達(dá)到高峰的時間。有研究表明，香煙暴露導(dǎo)致吞噬細(xì)胞的細(xì)菌清除能力下降[13]，從而進(jìn)一步說明香煙會使免疫反應(yīng)和免疫細(xì)胞的功能減退或反應(yīng)遲鈍，可能是后面細(xì)菌介入并導(dǎo)致真正的COPD急性加重的原因[14]。盡管如此，大量研究仍然表明，香煙煙霧的暴露，促進(jìn)流感病毒感染小鼠ROS的產(chǎn)生[11,15]，這可能與特定時間點以及病毒特性的差異有關(guān)。

氣道灌洗液蛋白主要包括氣道免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞所分泌的炎癥介質(zhì)、酶、黏蛋白等。本次實驗中小鼠氣道灌洗液蛋白含量在病毒感染后3、5、7 d，各組小鼠氣道灌洗液蛋白含量均明顯升高，且熏煙聯(lián)合攻毒組與假熏煙聯(lián)合攻毒組小鼠灌洗液蛋白含量在各時點無明顯差異。說明香煙煙霧暴露雖會引起流感感染小鼠氣道免疫細(xì)胞募集以及殺傷力高峰的延遲，但并沒有改變氣道炎癥介質(zhì)等分泌蛋白的總體水平。研究表明，香煙煙霧可引起或加重與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的多種肺部疾病，并可影響流感病毒導(dǎo)致的細(xì)胞因子的表達(dá)[16-17]，與本研究并不一致，原因可能在于灌洗液中蛋白總體水平與細(xì)胞因子分泌的水平不一致。