熊 剛，鄒 華，胡承蓮，吳 丹，鄧貴柳

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院急診科，恩施 445000）

由于人類生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，消化道疾病的發(fā)病率及病死率也不斷受到高度重視。結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性病變，其發(fā)生率僅次于胃癌、食管癌和肺癌等癌癥，并且流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)其致死率位居第3位[1]。對(duì)于惡性腫瘤的治療仍然依靠手術(shù)，而術(shù)前、術(shù)后的輔助化療也是必不可少的環(huán)節(jié)，但是臨床上常發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥[2-3]。于是，腫瘤細(xì)胞的耐藥問題是目前急需解決的難題，早期研究已提出中藥也具有較好的抗腫瘤活性，而且還具有毒性作用小的特點(diǎn)[4]。綠原酸（ChA）是植物體中重要的次生代謝產(chǎn)物，主要分布于杜仲、金銀花等多種植物中，ChA在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面也具有較好的藥理活性[5-6]，其中包括能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[7]，而且還能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[8]。前期報(bào)道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞自噬均與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)[9]。因此，文章考察了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-gp）、肺抗藥性相關(guān)蛋白（LRP）及自噬蛋白Beclin1、高遷移率足蛋白B1（HMGB1）在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞耐5-氟尿密啶（5-FU）中的作用，還觀察了ChA對(duì)P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1 蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)自武漢巴菲爾公司（來自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；綠原酸（大連金港制藥有限公司，批號(hào)：HSP20170211）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；5-FU（深圳玩樂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：SY20161107）；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司（批號(hào)WST-78）；RIPA裂解液購(gòu)自上海吉諾公司；BCA試劑盒購(gòu)自北京百奧公司；β-actin、P-gp、LRP、Beclin-1、HMGB1、p- 蛋 白 激 酶 B1（Akt1）、Akt1及mTOR抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G購(gòu)自上海谷歌公司；ECL 試劑盒（美國(guó) Pierce，批號(hào)：32106）。

1.2 主要儀器 BBS-DDC超凈工作臺(tái)（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；LRH-150 BOD CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海印溪儀器表有限公司）；Victor31420Multilable Counter酶標(biāo)儀（DX540，美國(guó)）；DYCZ-24DN 凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)）。

1.3 HCT116細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度為5%。5-FU耐藥的HCT116細(xì)胞系（HCT116-R）利用反復(fù)高濃度沖擊結(jié)合逐步遞增藥物劑量法[10]。具體步驟如下：將對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞用5 mg/L 5-FU干預(yù)24 h，用不含Ca2+、P3-的磷酸鹽緩沖液D-Hanks清洗1遍，并加入不含藥物的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，反復(fù)用5-FU沖擊處理，同時(shí)逐漸增大 5-FU 劑量（5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L），經(jīng)過8次沖擊后構(gòu)建成5-FU耐藥細(xì)胞系（HCT116-R）。待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后將其維持培養(yǎng)于10 mg/L 5-FU完全培養(yǎng)液中，酶2～3 d傳代1次，停藥2周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 ChA影響5-FU對(duì)HCT116細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 把對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞制備成懸液，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入不同濃度（0、100、200、400 mg/L）的 ChA 及不同劑量（0、10、40、80、120、160、200 mg/L）的 5-FU 干預(yù)細(xì)胞48h后，除去舊培養(yǎng)液，每孔加入10μLCCK8溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定細(xì)胞吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞活力，計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=細(xì)胞活力（%）=OD藥物組/OD對(duì)照組×100%。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)ChA對(duì)HCT116-R細(xì)胞系中自噬、耐藥相關(guān)基因的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，采用100、400 mg/L劑量ChA干預(yù)細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，并對(duì)核酸進(jìn)行濃度及純度法測(cè)定。吸去1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，程序設(shè)定為 30 ℃（10 min）→42 ℃（50 min）→85 ℃（10 min）→4℃（5 min）。根據(jù)試劑說明書，RT-PCR體系為20μL，cDNA2μL，引物4μL，2×FastFireqPCRPreMix 10 μL dd H2O 4 μL。擴(kuò)增條件設(shè)置為：94 ℃（10 min），94℃（15 s），60℃（1 min），循環(huán) 40次。以 β-actin作為內(nèi)參，基因引物序列見表1。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)ChA對(duì)HCT116-R細(xì)胞系中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，采用100、400 mg/L劑量ChA干預(yù)細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞冰上充分裂解30 min。收集細(xì)胞勻漿，4℃、離心半徑20cm，12000r/min離心13min，收集上清液，并采用BCA試劑測(cè)定總蛋白濃度；在蛋白電泳過程中，每孔蛋白上樣量為50 μg，濃縮膠70 V恒壓電離30 min，分離膠120 V恒壓電離90 min；然后將蛋白在275 mA恒流條件下轉(zhuǎn)至NC膜；5%脫脂牛奶封閉條帶1 h后，加入β-actin、LRP、Beclin-1、HMGB1、p-Akt1、Akt1 及 mTOR 抗體（稀釋比1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜后HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL顯色曝光，分析蛋白含量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences list

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD 法，若方差不齊采用 Dunnett’s T3 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ChA增強(qiáng)5-FU對(duì)HCT116細(xì)胞系增殖的抑制效應(yīng) 應(yīng)用不同濃度ChA及5-FU共同處理HCT116細(xì)胞系后，采用CCK8法考察ChA是否增強(qiáng)5-FU對(duì)HCT116細(xì)胞系增殖的抑制作用，見圖1。當(dāng)5-FU濃度保持不變時(shí)，隨著ChA劑量的增高，HCT116細(xì)胞活力明顯降低；當(dāng)ChA濃度保持不變時(shí)，較高濃度的5-FU能夠誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞增殖活力的明顯降低。提示5-FU呈濃度依賴性抑制HCT116細(xì)胞增殖，并且ChA能夠促使5-FU對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制作用。

2.2 HCT116、HCT116-R 細(xì) 胞 系 中 P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá)比較 為了考察自噬及耐藥蛋白表達(dá)在HCT116細(xì)胞耐5-FU的作用，因此采用Western Blot分析了HCT116、HCT116-R細(xì)胞系中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá)水平，見圖2。HCT116-R細(xì)胞系中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá)量相對(duì)于HCT116細(xì)胞均顯著升高，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示自噬及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)量的增高可能是HCT116細(xì)胞耐5-FU的機(jī)制。

圖1 ChA對(duì)呈濃度依賴性增強(qiáng)5-FU對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制效應(yīng)Fig.1 ChA enhanced the inhibitory effect of 5-FU on HCT116 cells in a dose-dependent manner

圖2HCT116、HCT116-R細(xì)胞系中自噬及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of autophagy and drug resistance related proteins in HCT116 and HCT116-R cell lines

2.3 RT-PCR檢測(cè) HCT116-R細(xì)胞 P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達(dá) 采用低、高劑量ChA干預(yù)HCT116-R細(xì)胞后，提取總RNA，檢測(cè)P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，ChA呈劑量性的抑制了HCT116-R細(xì)胞中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2RT-PCR分析HCT116-R細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達(dá)Tab.2 Expression of P-gp，LRP，Beclin-1 and HMGB1 mRNA in HCT116-R cells by RT-PCR detection

2.4 Western Blot檢測(cè)HCT116-R細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá) 采用低、高劑量ChA干預(yù)HCT116-R細(xì)胞后，提取總蛋白，檢測(cè)P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，ChA呈劑量性的抑制了HCT116-R細(xì)胞中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3。

圖3Western Blot分析HCT116-R細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of P-gp，LRP，Beclin-1 and HMGB1 protein in HCT116-R cells by Western Blot detection

2.5 Western Blot檢測(cè)HCT116-R細(xì)胞中Akt1-雷帕霉素靶蛋白（mTOR）分子通路蛋白 采用低、高劑量ChA干預(yù)HCT116-R細(xì)胞后，提取總蛋白，檢測(cè)自噬相關(guān)調(diào)節(jié)通路Akt1、mTOR蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，ChA呈劑量性的抑制了HCT116-R細(xì)胞中p-Akt1、Akt1、mTOR蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 4。

圖4 Western Blot分析HCT116-R細(xì)胞p-Akt1、Akt1、mTOR蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of p-Akt1，Akt1 and mTOR protein in HCT116-R cells by Western Blot detection

3 討論

腫瘤患者在接受化療治療中，較多患者都會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療效果的降低，產(chǎn)生醫(yī)療資源浪費(fèi)。于是，更多的國(guó)內(nèi)外研究人員集中于探索腫瘤耐藥機(jī)制及其治療方案。當(dāng)前雖然在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性方面已取得較大進(jìn)步，但是因?yàn)榇蠖鄶?shù)逆轉(zhuǎn)藥物存在毒副作用導(dǎo)致臨床上限制其應(yīng)用。中醫(yī)立足于辨證論治，以低毒、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)常用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥，可以顯著改善腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。近期研究報(bào)道ChA可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而下調(diào)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp、MRP1蛋白表達(dá)，從而有效逆轉(zhuǎn)人白血病細(xì)胞株的多藥耐藥[8]。于是，本研究探討了ChA對(duì)耐5-FU的HCT116細(xì)胞系的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及相關(guān)作用機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞耐藥主要集中于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體上，其中P-gp可介導(dǎo)多數(shù)化療藥物外排，由于腫瘤細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平的上調(diào)，導(dǎo)致P-gp介導(dǎo)化療藥物外排的活性增高，引起細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度降低。其中P-gp、肺抗藥性相關(guān)蛋白（LRP）屬于細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，抗腫瘤藥物可由細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)外排增多，進(jìn)而降低了藥物在細(xì)胞中積累，抑制了化療藥物的抗腫瘤活性。Levatic J等[11]報(bào)道Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的耐藥性也許與激活P-gp蛋白表達(dá)有關(guān)，在多種腫瘤細(xì)胞中，P-gp能夠利用腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）提供的能量介導(dǎo)藥物的外排升高而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。LRP蛋白主要表達(dá)于體腔上皮、巨噬細(xì)胞、血腦屏障及分泌性器官[12]，通過減少細(xì)胞內(nèi)DNA損傷藥物含量，進(jìn)而減弱藥物對(duì)DNA的損傷作用，導(dǎo)致順鉑、烷化劑及5-FU的耐藥。已有研究報(bào)道LRP在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)[13]，進(jìn)而誘導(dǎo)耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)ChA可以誘導(dǎo)5-FU對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖活力的抑制作用，還能抑制HCT116-R細(xì)胞中P-gp、LRP mRNA及蛋白的表達(dá)。表明ChA能夠逆轉(zhuǎn)HCT116細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥，可能與降低細(xì)胞膜上P-gp、LRP蛋白表達(dá)，進(jìn)而提升化療藥物在腫瘤細(xì)胞中的積累有關(guān)。

相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與耐藥性密切相關(guān)，證實(shí)通過抑制腫瘤細(xì)胞自噬，可提升患者對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)自噬相關(guān)基因的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性[14]。Bieri等[15]也證實(shí)抑制自噬基因Beclin-1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。文章研究發(fā)現(xiàn)ChA干預(yù)HCT116-R細(xì)胞，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、高遷移率族蛋白B-1（HMGB1）呈藥物劑量依賴性表達(dá)降低，降低了腫瘤細(xì)胞的自噬過程。Akt1/mTOR信號(hào)通路可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、耐藥及自噬，并且該信號(hào)傳導(dǎo)激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16]。并且早期研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過阻滯Akt1/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，通過降低Akt1、mTOR信號(hào)分子表達(dá)水平提升化療藥物的殺傷效果[17]。研究觀察到在HCT116-R細(xì)胞系中ChA能夠降低Akt1、mTOR基因表達(dá)，進(jìn)而抑制Akt1/mTOR信號(hào)通路的活性，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，然而ChA是否直接與Akt1/mTOR信號(hào)通路分子發(fā)生相互作用來改變耐藥基因及自噬基因的表達(dá)，有待進(jìn)一步深入研究。