黃 羚，江 媚

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

葉天士聰敏好學，不僅醫(yī)術高超而且醫(yī)德高尚，一生臨證不輟，為后世留下了寶貴的經驗。其作《臨證指南醫(yī)案》思路清晰，文字簡約，可謂真才實學，被后世奉為醫(yī)案學習的典范，有很高的參考價值。本研究借助中醫(yī)傳承輔助平臺挖掘《臨證指南醫(yī)案·淋帶》的用藥規(guī)律，并通過網絡藥理學方法對葉天士的用藥經驗進行疾病靶點的關聯(lián)研究，充分挖掘以葉天士治療淋帶的現(xiàn)代藥理學意義，為臨床治療女性泌尿生殖系統(tǒng)疾病提供理論依據。

1 研究對象

選錄自葉天士《臨證指南醫(yī)案·淋帶》[1]，選取患者病案，記錄全部診次組方。

2 方法

2.1 資料錄入及處理 將上述篩選后的病案資料錄入中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)（TCMISS）2.5版本，由雙人負責審核。通過“數據分析”模塊中的“方劑分析”功能，進行用藥規(guī)律挖掘。統(tǒng)一藥物名稱，如“湖蓮”及“建蓮肉”輸入為“蓮子”，“川斛”輸入為“石斛”，“樗根皮”輸入為“椿根皮”，“柏子仁霜”輸入為“柏子仁”。對于系統(tǒng)中不能自動生成的藥物進行手工輸入，無剔除藥物。

2.2 《臨證指南醫(yī)案·淋病》治療淋帶組方數據分析

2.2.1 頻次統(tǒng)計分析 將醫(yī)案中每首方劑中每味藥的出現(xiàn)頻次從大到小排序，對藥物的性味歸經屬性進行統(tǒng)計，由大到小排序，以各屬性的數量與分類總數量的比值為所占比，分別將結果導出。

2.2.2 性味歸經分析 依據《中華人民共和國藥典》標準，將頻次≥3次的藥物16味藥物的四氣（寒、涼、溫、熱、平）、五味（酸、苦、甘、辛、咸、澀）、歸經（肝、心、脾、肺、腎、膽、小腸、胃、大腸、膀胱、三焦及心包經）進行統(tǒng)計。

2.2.3 組方規(guī)律分析 “支持度個數”設為4（支持度為8.0%），置信度設為0.6，按藥物組合出現(xiàn)頻次從大到小的順序進行排序；點擊“規(guī)則分析”分析所得的規(guī)則。

2.2.4 新組方分析 結合臨床經驗和不同參數的數據預讀，設置相關度為5，懲罰度為2，進行聚類分析；以改進的互信息法藥物關聯(lián)度分析結果為基礎，按照相關度與懲罰度約束，基于復雜系統(tǒng)熵聚類，演化出藥物核心組合；在以上核心組合提取的基礎上，運用無監(jiān)督熵層次聚類算法，發(fā)現(xiàn)新組方，并進行網絡可視化展示。

2.3 《臨證指南醫(yī)案》治療淋帶基本組方機制研究

2.3.1 相關作用靶標數據庫的構建 在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）、中藥網絡數據庫及分析系統(tǒng)（TCM-Mesh）、中藥成分靶點數據庫（HIT）、中藥信息數據庫（TCM-ID）中，預測“茯苓、桑螵蛸、桂枝、牡蠣、阿膠、枸杞子、沙苑子”的靶標，提取共有藥物靶標，形成基本組方-中藥-靶標聯(lián)系網絡。在人類表型術語集（HPO）、DrugBank數據庫、毒性與基因比較數據庫（CTD）中，搜索與“淋帶”相對應的女性泌尿生殖系統(tǒng)相關的所有疾病，尿路感染、膀胱炎、尿道綜合征、泌尿道結核、尿路結石、盆腔炎、附件炎、子宮內膜炎、宮頸炎、陰道炎等病，獲得“女性泌尿生殖系統(tǒng)疾病、泌尿生殖系統(tǒng)疾病、外陰念珠菌病、復發(fā)性金黃色葡萄球菌感染、復發(fā)性尿路感染”等疾病靶標，提取交集后作為“淋帶”的疾病靶標，形成疾病-靶標聯(lián)系網絡。并通過全球蛋白質資源數據庫（UniProt）翻譯成相應基因。

2.3.2 各靶標間相互作用關系的構建 在蛋白質數據搜索工具（STRING）中，選擇多種蛋白質后，輸入相關靶標名稱，在生物中選擇人類進行檢索，得到相應蛋白關系圖，選擇分子作用進行分析，記錄蛋白間相互作用類型及得分。

2.3.3 治療淋帶組方相關生物功能和通路富集分析 在STRING平臺進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）的信號通路富集分析和基因本體（GO）的生物過程富集分析，以P＜0.05進行靶基因篩選，分析新組方發(fā)揮藥理作用的主要信號通路及生物過程，整理相關通路數據。

3 結果

3.1 用藥頻次 在21首處方中，共使用藥物54味。使用頻次最多的藥物是茯苓，使用12次。使用頻次≥3次的藥物共計16味。依次是茯苓、枸杞子、人參、當歸、沙苑子、阿膠、杜仲、蓮子、牡蠣、桑螵蛸、芡實、鹿角霜、白芍、五味子、茯神、桂枝。見表1。

3.2 藥物性味歸經 54味藥物的屬性中，四氣性溫的藥最多，占44.37%；五味屬甘的藥最多，占50.00%；歸腎經的藥最多，均占28.61%。見表2。

3.3 常用藥物功用分類 基于《中藥學》對使用超過2次的中藥進行主要功用分類，發(fā)現(xiàn)使用頻次最多的是補陽氣藥，如沙苑子、杜仲、鹿角霜、肉蓯蓉、鹿茸、菟絲子、補骨脂等。桑螵蛸、芡實、五味子、海螵蛸、禹余糧等收斂藥的使用僅次于補陽藥。另有安神藥、補血藥、清熱藥也是常用配伍，見表3。

表1 方劑中使用頻次3以上的藥物情況表Tab.1 Drugs with a frequency of more than 3 times in prescriptions 次

表2 方劑中藥物性味歸經情況表Tab.2 Situation of drug flavor and meridian tropism in prescriptions

3.4 基于關聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律 得到常用藥物組合共30個，頻次最大的藥物組合為“人參、茯苓”，出現(xiàn)7次；其次為“枸杞子、茯苓”，“當歸、枸杞子”，“沙苑子、枸杞子”，各出現(xiàn)6次。在置信度較高的藥物組合中，顯示沙苑子-枸杞子、桑螵蛸-茯苓、牡蠣-阿膠等為常用藥物組合。按出現(xiàn)頻次由高到低排序，見表4；分析所得的藥對和藥物組合的用藥規(guī)律，見表5。

表3 《臨證指南醫(yī)案·淋帶》高頻藥物功用分類表Tab.3 Classification of high frequency drug function in Guide to Clinical Practice with Medical Record：Lindai

表4 治療淋帶組方中的藥物組合（支持度≥4，置信度≥0.6）Tab.4 Drug combination in the prescription for treating lindai(degree of support≥4，degree of confidence≥0.6)

3.5 基于熵聚類的方劑組方規(guī)律 得到處方中兩兩藥物間的關聯(lián)度共1 331條，將關聯(lián)系數0.05以上的藥對，治療淋帶組方中的潛在藥對共30條，見表6?；陟鼐垲愃惴ǖ贸龅年P聯(lián)度結果，以相關度與懲罰度為規(guī)范，演算出治療淋帶組方中的的核心組合，見表7。基于復雜熵聚類算法的治療淋帶新方，見表8。

3.6 各靶標間的相互作用 通過檢索，得到治淋帶基本組方的靶標基因為1 192個，淋帶的靶標基因為52個，經交集顯示，藥物-疾病交集靶標基因為10個。治淋帶基本組方的潛在靶標與疾病靶標之間的蛋白質-蛋白質相互作用信息（PPI）通過STRING獲得。網絡中包含10個節(jié)點，平均局部聚類系數為 0.333，PPI富集 P 值為 0.004 01。見圖 1。其中，有5項相關靶標的相互作用，見表9。

表5 治療淋帶組方中藥物的關聯(lián)規(guī)則（置信度≥0.75）Tab.5 Association rules of drugs in the prescription for treating lindai(degree of confidence≥0.75)

表6 治療淋帶組方中的潛在藥對（關聯(lián)系數≥0.05）Tab.6 Potential drug combinations in the prescription for treating lindai(correlation≥0.05)

表7 治療淋帶組方中的核心組合Tab.7 Core combination in the prescription for treating lindai

表8 基于復雜熵聚類算法治療淋帶新方組合Tab.8 New prescriptions for treating lindai based on complex entropy dustering

圖1 基于STRING的藥物—疾病靶標相互作用圖Fig.1 Drug-disease target interaction based on STRING

3.7 治淋帶基本組方的GO功能富集 對交集靶標基因進行GO生物過程富集，篩選到P＜0.05的GO條目57個，按照P值由小到大排列的前20條主要生物過程見表10。結果顯示，其GO基因生物功能主要涉及：和生殖系統(tǒng)相關的子宮發(fā)育、男性性腺發(fā)育、男性原發(fā)性特征的發(fā)展、男性性別分化；和免疫炎癥相關的toll樣受體信號通路的正調控、toll樣受體信號通路的調控、腫瘤壞死因子產生的調控、中性粒細胞介導免疫、細胞對內源性刺激的反應；和自由基活動相關的呼吸爆發(fā)、血管內皮生長因子受體信號通路、超氧陰離子生成；和代謝相關的細胞對L-谷氨酰胺的反應、對醛固酮的反應、過氧化氫生物合成工藝、前體代謝產物和能量的產生、輔助因子代謝過程、電子傳輸鏈、粒作用、分泌。

表9 治淋帶基本組方的相關靶標相互作用（關系數≥0.417）Tab.9 Related target interactions of the basic prescriptions for treating lindai(confidence≥0.417)

3.8 治淋帶基本組方的KEGG信號通路分析 篩選出P＜0.05的信號通路共6條，按照P值由小到大排列的KEGG信號通路見表11。分別是利什曼病、白細胞經內皮遷移、吞噬小體信號通路、破骨細胞分化、流體剪切力與動脈粥樣硬化、NOD樣受體信號通路。

其中，結果顯示細胞色素b245輕鏈抗體（CYBA），細胞色素b245重鏈抗體（CYBB），中性粒細胞胞質因子2（NCF2）參與了吞噬小體信號通路；CYBA和CYBB參與了NOD樣受體信號通路，與女性泌尿生殖系統(tǒng)疾病的炎癥免疫反應密切相關。

表10 治淋帶基本組方的基因功能分析（前20）Tab.10 Analysis of gene function of the basic prescriptions for treating lindai(top 20)

表11 治淋帶基本組方的KEGG信號通路分析Tab.11 KEGG signal pathways analysis of the basic prescriptions for treating lindai

4 討論

4.1 淋帶的病因病機 淋帶，實為淋證和帶下病之合稱[2]。淋帶對應現(xiàn)代當屬泌尿及生殖系統(tǒng)感染相關的疾病。腎虛膀胱氣化不利，水積膀胱，日久釀成濕熱則氣化更失疏利，或腎虛不能上滋心陰，心火過旺，下劫腎水，心陰無源，與腎相表里之腑膀胱受熱灼，水道不利而致淋證。帶脈失約是目前較公認的“帶下”病因病機提要。熱、毒、濕、寒、瘀傷及任帶二脈，使任脈不固，帶脈失約而導致帶下病。

4.2 葉天士治淋帶思想 葉天士對淋帶病的病因病機及治法有獨特的見解，其醫(yī)案中實證多以心火下熾、濕熱下注為主，治療以清熱利濕，分利清濁為法；虛證可見溫邪傷陰、血虛脈滯、血虛風動、津涸風動、肝腎陰虛、陰陽兩虛等，治以寒熱平調、顧護陰液、不傷陰陽為立法。其核心病因病機多是由于腎水耗竭，不能上濟心陰，心腎不交，腎水不能上濟心火，心火下迫膀胱、胞宮胞脈導致，治療宜交通心腎[3]。研究發(fā)現(xiàn)，葉天士治療淋帶病的藥物中使用頻次最多的藥物是茯苓，其次是枸杞子、人參、當歸、沙苑子、阿膠、杜仲、蓮子、牡蠣、桑螵蛸、芡實、鹿角霜、白芍、五味子、茯神、桂枝等交通心腎及滋補肝腎之品；藥物的屬性中，性溫的、屬甘的、歸腎經的藥最多；通過中藥主要功用分類，發(fā)現(xiàn)使用頻次最多的是沙苑子、杜仲、鹿角霜、肉蓯蓉、鹿茸、菟絲子、補骨脂等補陽氣藥；桑螵蛸、芡實、五味子、海螵蛸、禹余糧等收斂藥的使用僅次于補陽藥，另有安神藥、補血藥、清熱藥也是常用配伍；藥物組合規(guī)律顯示沙苑子-枸杞子、桑螵蛸-茯苓、牡蠣-阿膠等為常用藥物組合，也體現(xiàn)了其交通心腎、滋補肝腎的治療法則。

通過熵聚類分析得出葉天士治療淋帶有兩個基本方?；痉街挥绍蜍?、桑螵蛸、桂枝、牡蠣組成。方中茯苓也是葉天士治療本病使用次數最多的藥物，茯苓性甘、淡，甘補扶正，淡滲除濕；桑螵蛸為補腎固精，收澀縮尿之要藥；桂枝辛能通陽助膀胱氣化，溫能散寒濕；牡蠣斂陰固澀，配伍桂枝能調陰陽，和營衛(wèi)，澀精液，全方共奏下補腎水，上濟心火，交通心腎之功。若失治誤治，久治不愈，病情遷延，余毒不解，耗氣傷津，腎陰漸虧，或素體陰虛，肝腎陰虛而正虛毒戀，虛實夾雜，反復發(fā)作，基于“治病求本”的原則，治療以滋補肝腎為主?；痉街砂⒛z、枸杞子、沙苑子、牡蠣組成。方中阿膠甘，平，歸肺、肝、腎經。具有補血滋陰潤燥之功。枸杞子甘，平，歸肝、腎經，為滋補肝腎良藥。沙苑子甘，溫，歸肝、腎經，具有補肝益腎，明目固精之功。牡蠣咸，微寒，歸肝、膽、腎經滋陰潛陽，全方配伍達滋補肝腎之功。在淋帶早期葉天士以交通心腎，滋腎降心火為主。“諸液耗，必陰傷。”故在淋帶后期的治療以滋補肝腎為主。

4.3 治淋帶基本組方的核心靶標及可能的作用途徑 中醫(yī)治療淋帶有整體治療的優(yōu)勢，中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，越來越多地被運用到淋帶的治療當中。

通過網絡藥理學方法預測葉天士治淋帶基本組方的GO功能富集和KEGG信號通路，筆者發(fā)現(xiàn)，治淋帶基本組方的生物功能主要集中在免疫炎癥以及激素調節(jié)等方面。這與現(xiàn)代相關藥理研究結果一致，如楊曉娜等[4]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)扶正祛濕中藥可通過對血清和局部組織的炎癥細胞因子以及粘連相關免疫分子的調節(jié)，有效緩解盆腔粘連，改善機體免疫功能。由于卵巢功能衰退，或卵巢手術史，雌激素水平下降，導致陰道黏膜萎縮、陰道上皮細胞內糖原減少，陰道pH值增高，局部抵抗力減弱，極易受細菌感染而引發(fā)老年性陰道炎癥，同時多伴有泌尿系統(tǒng)的感染。中醫(yī)學認為，老年性陰道炎的發(fā)生以腎虛為基礎，因年老或刀刃創(chuàng)傷導致腎氣不足，肝腎陰虛，易致化燥生風及濕熱外邪侵襲而發(fā)病。王錦秀等[5]通過運用滋補肝腎中藥治療老年性陰道炎取得了良好效果，其可能通過提高女性的雌激素水平，提高陰道細胞的免疫力，增強陰道自凈作用而發(fā)揮效應。

通過研究還發(fā)現(xiàn)，葉天士治療淋帶基本方可能通過吞噬小體信號通路、NOD樣受體信號通路等免疫炎癥相關通路發(fā)揮治療作用。病原體入侵時，首先被吞噬細胞吞噬并形成吞噬小體，直接殺傷病原體，或者激活免疫反應，釋放促炎細胞因子，發(fā)揮抗菌作用[6]。NOD樣受體信號通路是細胞內重要信號傳導通路，NOD樣受體作為胞內模式識別受體是細菌感染的先天免疫傳感器的識別器，通過抗原提呈激活機體的免疫炎癥反應[7]。淋帶的發(fā)病從現(xiàn)代醫(yī)學的角度來看，多為細菌、真菌、支原體等病原體侵襲，造成泌尿生殖系統(tǒng)感染。此時，吞噬小體通路和NOD樣受體信號通路被啟動，其兩者均可啟動機體的免疫應答和炎癥反應，提示在遣方用藥的時候，可選擇能夠調控吞噬小體通路、NOD樣受體信號通路關鍵蛋白的中藥等[8]，發(fā)揮治療淋帶的作用。

5 結論

葉天士治療淋帶病早期以交通心腎為主，淋帶后期以滋補肝腎為主，體現(xiàn)了葉氏的辨證分期論治的診療模式。其治療機制可能為免疫炎癥以及激素調節(jié)等，同時受多條信號通路的共同影響。