周海巖，周建寶，易曉男，李勉，柳志強(qiáng)*

1(浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014) 2(手性生物制造國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014) 3(浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 開(kāi)化，324302)

昆布多糖是一類存在于海洋藻類中的聚糖，基本結(jié)構(gòu)包括以β-1,3-糖苷鍵連接的葡萄糖作為主鏈，在結(jié)構(gòu)內(nèi)部還含有β-1,6-糖苷鍵。作為一類與纖維素等多糖結(jié)構(gòu)類似的自然資源，昆布多糖在生物燃料行業(yè)中也可作為發(fā)酵底物而發(fā)揮重要的作用[1-2]。據(jù)報(bào)道，褐藻中的昆布多糖可被細(xì)菌昆布多糖酶水解從而進(jìn)行乙醇生產(chǎn)[3]。昆布多糖酶(EC 3.2.1.6)，又稱β-1,3-葡聚糖酶，是能夠催化β-D-葡聚糖中1,3-糖苷鍵和1,4-糖苷鍵斷裂的一類糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)。在細(xì)菌中，昆布多糖酶包括外切β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.58)和內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)，都可將昆布多糖及其結(jié)構(gòu)類似的多糖水解為單糖或寡糖[4]。據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，昆布多糖酶分布于GH3、GH5、GH16、GH17、GH55、GH64、GH81、GH128、GH152、GH157和GH158家族；GH16家族的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶所占比例最大[5]。

有研究人員以大腸桿菌(Escherichiacoli)為宿主對(duì)昆布多糖酶進(jìn)行表達(dá)，如FLamA和FLamB[6]、Mzl86[7]和GFA[8]等。這些酶在E.coli中表達(dá)水平較低，最適溫度基本處于45～55 ℃，且熱穩(wěn)定性和pH耐受能力一般，難以滿足工業(yè)化應(yīng)用需求。因此，開(kāi)發(fā)不同來(lái)源的昆布多糖酶并選擇更適合的表達(dá)系統(tǒng)具有重要的意義。研究表明，嗜鹽微生物及其相關(guān)基因在工業(yè)應(yīng)用中具有巨大的潛力[9-11]。嗜鹽紅色鹽桿菌Rhodohalobacterbarkolensissp. 15182T是從鹽湖中分離的一種新型嗜鹽非運(yùn)動(dòng)型細(xì)菌，其最適生長(zhǎng)鹽質(zhì)量濃度為20～30 mg/mL[12]。UniProt[13]數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，該菌基因組中含有豐富的GH基因，包括GH16家族的昆布多糖酶基因。因此，開(kāi)發(fā)R.barkolensis來(lái)源的昆布多糖酶用于高鹽環(huán)境中昆布多糖等多糖的降解具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。畢赤酵母(Pichiapastoris)作為真核生物表達(dá)系統(tǒng)，不僅能對(duì)重組蛋白進(jìn)行必要的修飾加工、分泌表達(dá)調(diào)控和高密度發(fā)酵，而且自身蛋白分泌較少，更有利于后續(xù)的分離純化等操作[14]。本文采用畢赤酵母GS115為表達(dá)宿主對(duì)來(lái)源于R.barkolensis的昆布多糖酶RbLam16進(jìn)行基因克隆和表達(dá)，然后對(duì)RbLam16進(jìn)行表征和生產(chǎn)條件優(yōu)化,以期為昆布多糖酶在生物質(zhì)資源化中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliDH5α及質(zhì)粒pPIC9K由旭冠生物科技有限公司提供，畢赤酵母GS115由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase, azyme(南京)公司；SacI,NEB(北京)有限公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR清潔試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒,Axygen(杭州)有限公司；氨芐青霉素、遺傳霉素G418、蛋白Marker、核酸染料,上海生工；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒,凱基生物；昆布多糖,百靈威；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 5，蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。

MD(minimal dextrase)培養(yǎng)基(g/L)：酵母無(wú)氨基氮源(yeast nitrogen base，YNB)13.4，葡萄糖 20，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。待培養(yǎng)基溫度降至60℃以下，補(bǔ)加終濃度為400 μg/L的生物素溶液。

基本培養(yǎng)基(minimal medium，MM)(g/L)：YNB 13.4，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。使用前補(bǔ)加終濃度為400 μg/L的生物素溶液，以0.5%(體積分?jǐn)?shù))的比例補(bǔ)加甲醇。

緩沖型最小甘油復(fù)合(buffered minimal glycerol-complex，BMGY)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH 6.0)10%(體積分?jǐn)?shù))，丙三醇1%(體積分?jǐn)?shù))。使用前補(bǔ)加終濃度為400 μg/L的生物素溶液。

緩沖型甲醇復(fù)合(buffered methanol-complex，BMMY)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH 6.0)10%(體積分?jǐn)?shù))。使用前補(bǔ)加終濃度為400 μg/L的生物素溶液。

1.1.4 主要儀器

TAd anced 96/96G PCR儀，德國(guó)Analytikjena；Bio-Rad瓊脂糖凝膠電泳儀、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)、Bio-Rad電穿孔儀、Bio-ScaleTM鎳柱及蛋白純化儀，美國(guó)Bio-Rad公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國(guó)Thermo公司；ThermoMIXER C恒溫混勻儀，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 序列分析

昆布多糖酶RbLam16的氨基酸序列(GenBank ID:PKD44866.1)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得；使用SignalP 4.1[15](http://www.cbs.dtu.dk/ser ices/SignalP-4.1/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；蛋白分子量和等電點(diǎn)(pI)使用ProtParam[16](https://web.expasy.org/protparam/)工具；蛋白親疏水性使用ProtScale[16](https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行分析；氨基酸多序列比對(duì)以及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別使用Clustal Omega[17](https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和ESPript 3.0[18](http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript)。

1.2.2 基因克隆及重組表達(dá)

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)RbLam16基因序列進(jìn)行優(yōu)化，目的基因大小為798 bp，G+C含量為48%。優(yōu)化后的RbLam16基因于3′端加入6個(gè)His-Tag序列，并在5′和3′端分別加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，由上海旭冠生物公司合成、構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/rblam16，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中。

將含有pPIC9K/rblam16的E.coliDH5α經(jīng)含有氨芐的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用試劑盒提取質(zhì)粒并純化。純化產(chǎn)物經(jīng)SacI進(jìn)行線性化，電泳驗(yàn)證并膠回收線性化產(chǎn)物。

將線性pPIC9K/rblam16電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，在MD平板培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d(30 ℃)。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至含不同G418質(zhì)量濃度(0.25、0.5和1.0 mg/mL)的YPD平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取G418最高質(zhì)量濃度平板上的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物為α-Factor(5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′)和3′AOX(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)。

挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種至25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌體OD600為2～6；離心(4 ℃、5 000 r/min，5 min)收集菌體，轉(zhuǎn)接至35 mL BMMY培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h添加1%(體積分?jǐn)?shù))純甲醇誘導(dǎo)RbLam16表達(dá)。同時(shí)，每24 h取樣離心(4 ℃、8 000 r/min,10 min)進(jìn)行SDS-PAGE分析。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心、Bio-ScaleTM鎳柱純化以及SDS-PAGE分析。蛋白濃度使用BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 酶活力測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[19]測(cè)定RbLam16的酶活力。將150 μL 10 mg/mL昆布多糖溶液溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0)在55 ℃預(yù)熱10 min，加入純化后的酶液50 μL。55 ℃、500 r/min反應(yīng)2.5 min；立即加入200 μL DNS溶液，混勻后于沸水中加熱10 min，冷卻后在560 nm測(cè)定吸光值；根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖的量。酶活力單位定義：在55 ℃、pH 7.0條件下，每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 RbLam16最適反應(yīng)溫度及pH

為測(cè)定RbLam16的最適反應(yīng)溫度，設(shè)定35、45、55、65、75、85和95 ℃ 7組反應(yīng)溫度。按照1.2.3小節(jié)中酶活力測(cè)定方法分別測(cè)定上述條件下的酶活力。為測(cè)定RbLam16的最適反應(yīng)pH，分別用100 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0～6.5)、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.5～8.5)和50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 8.5～10.5)配制不同pH的昆布多糖溶液。按照1.2.3小節(jié)中酶活力測(cè)定方法在最適溫度下測(cè)定各組酶活力。

1.2.4.2 RbLam16熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性

將酶液分別在45、55、65 ℃保溫30 min，每5 min取樣在最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活力，將未保溫的酶液活力設(shè)為100%，考察RbLam16的熱穩(wěn)定性。將酶液分別在4 ℃不同pH緩沖液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5)存放24 h，每12 h在最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活力，以未做處理的酶液活力為100%，考察RbLam16的pH穩(wěn)定性。

1.2.4.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

為考察金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響，向反應(yīng)體系中加入終濃度為5 mmol/L的MnCl2、KCl、CoCl2、NiCl2、NaCl、CaCl2、MgSO4、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、(NH4)2SO4、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定各組酶活力；以不加金屬離子或化學(xué)試劑的反應(yīng)酶活力作為100%。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

為研究培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、甲醇添加比例和發(fā)酵時(shí)間對(duì)GS115/pPIC9K/rblam16生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶的影響，分別將BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體離心后轉(zhuǎn)接至不同pH(4、5、6和7)的BMMY培養(yǎng)基中，在不同的發(fā)酵溫度(26、28、30和32 ℃)、150 r/min發(fā)酵，每24 h以不同的體積比例(0.5%、1.0%、1.5%及2.0%)添加甲醇。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心(4 ℃、8 000 r/min，10 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后作為粗酶液進(jìn)行酶活力測(cè)定；菌體干燥后測(cè)定生物量。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列分析

來(lái)源于R.barkolensis的昆布多糖酶RbLam16一級(jí)序列包含285個(gè)氨基酸殘基，在N端1-21位存在信號(hào)肽(MFNFHPIILSLLMALSLTSCA)。成熟RbLam16的分子質(zhì)量為29.62 kDa，pI為4.43。蛋白平均親水性系數(shù)為-0.657 1，預(yù)測(cè)為親水蛋白。RbLam16的序列與同家族的ULam111[4]序列相似性為42%，與RmLamR[20]、BglF[21]、pfLamA[22]和TmLam[23]相似性分別為41%、39%、42%和39%。以ULam111(PDB ID：5 WUT_A)為模板對(duì)RbLam16進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖1所示。

圖1 多序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Multi-sequence alignment and secondary structure prediction

RbLam16二級(jí)結(jié)構(gòu)包括2個(gè)α螺旋和18個(gè)β片層，具有GH16家族典型的“β-jelly roll”結(jié)構(gòu)；存在Arg89、Trp116、Trp120和His154等4個(gè)保守氨基酸殘基(黑色星號(hào)標(biāo)記)以及Glu136、Asp138和Glu141等3個(gè)催化殘基(橙色星號(hào)標(biāo)記)。

2.2 基因克隆及表達(dá)純化

將質(zhì)粒pPIC9K/rblam16線性化處理后，電轉(zhuǎn)至GS115感受態(tài)細(xì)胞中，單菌落通過(guò)PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。重組菌通過(guò)甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)目的蛋白，粗酶液經(jīng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。

a-重組質(zhì)粒pPIC9K/rblam16：M-DL5000 DNA marker，1、2-PCR產(chǎn)物(1.2 kbp)；b-重組質(zhì)粒Sac I單酶切線性化：M-1 kb DNA Ladder marker,1-環(huán)狀質(zhì)粒對(duì)照,2、3、4-線性化產(chǎn)物(10 kbp)；c-GS115/pPIC9K/rblam16陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選：M-DL5000 DNA marker，1、2、3-菌落PCR產(chǎn)物(1.0 kbp)圖2 核酸瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Nucleic acid agarose gel electrophoresis

a-發(fā)酵上清液SDS-PAGE:M-蛋白Marker,1、2、3、4分別為24、48、72、96 h發(fā)酵上清液；b-純酶液SDS-PAGE:M-蛋白Marker,1-純化產(chǎn)物(30 kDa)圖3 RbLam16的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the RbLam16

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 RbLam16最適反應(yīng)溫度及pH

如圖4-a所示，RbLam16的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，此時(shí)酶活力為155.32 U/mg。當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)，酶活力開(kāi)始下降，而在95 ℃時(shí)仍有69.19 U/mg的酶活力，表明該酶對(duì)高溫有一定的耐受力。與已報(bào)道的昆布多糖酶GFA[8](來(lái)源于Formosaalgae，最適溫度45 ℃)、LA-Lam[24](來(lái)源于Pseudoalteromonas，最適溫度45 ℃)、LamC27[25](來(lái)源于Corallococcussp.，最適溫度45 ℃)和Mz186[7](來(lái)源于Mesofla ibacterzeaxanthinifaciens，最適溫度50 ℃)相比，RbLam16的最適反應(yīng)溫度更高。如圖4-b所示，RbLam16最適反應(yīng)pH為7.0，且在pH 4.5～10.5范圍內(nèi)酶活力均大于100 U/mg，說(shuō)明該酶的活性范圍較廣，在偏堿性的環(huán)境下仍能發(fā)揮催化作用。RbLam16與同家族的LamC27[25]最適反應(yīng)pH相當(dāng)，說(shuō)明2種酶更偏向在中性環(huán)境下發(fā)揮作用。

a-溫度對(duì)酶活力的影響; b-pH對(duì)酶活力的影響圖4 溫度及pH對(duì)RbLam16活力的影響Fig.4 The effect of temperature and pH on the acti ity of the RbLam16

2.3.2 RbLam16熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性

如圖5-a所示，在45 ℃下RbLam16的熱穩(wěn)定性最好，30 min后仍保留初始酶活力的88%左右；其次，在最適溫度55 ℃時(shí)也有較好的熱穩(wěn)定性，30 min后剩余酶活60%以上；而在65 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定較差，30 min后酶活力只有40%左右。與GFA[8](其在45 ℃下保存20 min酶活力僅剩余50%，在55 ℃保存10 min后已無(wú)活性)相比，RbLam16的熱穩(wěn)定更高。

如圖5-b所示，RbLam16在pH 7.5時(shí)穩(wěn)定性最好，24 h保存后仍殘余93%的酶活力；而在pH 6.0時(shí)穩(wěn)定性較差，24 h僅剩余67%左右的酶活力；在pH 6.5和pH 7.5時(shí)保存24 h，殘余酶活力均為初始酶活力的72%左右。有研究發(fā)現(xiàn)，GH50家族的PaBglu50A[26]在pH 4.0～8.0范圍時(shí)保存30 min后穩(wěn)定性較好，后期可以進(jìn)一步研究RbLam16在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。

a-RbLam16的熱穩(wěn)定性; b-RbLam16的pH穩(wěn)定性圖5 溫度及pH對(duì)RbLam16穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effects of temperature and pH on the stability of RbLam16

2.3.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

由表1可知，Mn2+和Co2+對(duì)RbLam16酶活均有促進(jìn)作用，酶活分別提高到122.96%和112.63%；Na+和Fe2+對(duì)RbLam16有輕微的抑制作用；而Cu2+、EDTA和SDS對(duì)RbLam16有較強(qiáng)的抑制作用，相對(duì)酶活分別為59.98%、51.75%和38.88%；其他試劑對(duì)RbLam16也有一定的抑制作用，酶活力均為對(duì)照的85%左右。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)RbLam16酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemicals on the acti ity of RbLam16

據(jù)報(bào)道，Mn2+對(duì)昆布多糖酶Mz186[7]和LamC27[25]也具有促進(jìn)作用，可能它們的蛋白結(jié)構(gòu)存在某種相似性，從而產(chǎn)生相似的作用效果。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

研究表明，不同pH環(huán)境對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白分泌表達(dá)產(chǎn)生重要影響，過(guò)酸或過(guò)堿均會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致菌體死亡[27]。如圖6-a所示，GS115/pPIC9K/rblam16的生物量在pH 6.0時(shí)達(dá)到高。在pH 4.0～6.0時(shí)，酶活力由12.51 U/mL提高至16.88 U/mL；而在pH 7.0時(shí)，酶活力開(kāi)始降低。綜合考慮，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH為6.0。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

在不同的培養(yǎng)溫度下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝均會(huì)發(fā)生變化，直接或間接影響蛋白的分泌表達(dá)[27]。如圖6-b所示，在不同溫度下，生物量和酶活力呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，當(dāng)生物量達(dá)到最大時(shí)，酶活力也最高；反之亦然。在28 ℃時(shí)，兩者達(dá)到最高水平，分別為31.95 g/L和19.52 U/mL。因此，發(fā)酵的最適溫度為28 ℃。

a-pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響;b-溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖6 發(fā)酵液初始pH和發(fā)酵溫度對(duì)重組GS115/pPIC9K/rblam16生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Fig.6 The effects of initial pH and fermentation temperature on the growth and enzyme production of recombinant GS115/pPIC9K/rblam16

2.4.3 甲醇添加比例對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，可利用甲醇可作為誘導(dǎo)劑促進(jìn)重組酶的分泌表達(dá)[14]。由圖7-a可知，在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，提高甲醇添加比例，生物量和酶活力也相應(yīng)的增加，在甲醇添加比例為1.5%時(shí)，兩者達(dá)到最高，分別為27.5 g/L和21.84 U/mL；而過(guò)高的添加量(2%)對(duì)重組菌產(chǎn)生毒性作用。因此，最適甲醇添加比例為1.5%。

2.4.4 發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

由圖7-b可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行(24～120 h)，生物量和酶活力逐漸增加，在120 h時(shí)均達(dá)到最高值，分別為27.73 g/L和27.42 U/mL。而當(dāng)發(fā)酵延長(zhǎng)至144 h時(shí)，生物量和酶活力均有所下降。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為120 h。

a-甲醇添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響; b-發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖7 甲醇添加比例和發(fā)酵時(shí)間對(duì)重組GS115/pPIC9K/rblam16生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Fig.7 The effects of methanol addition ratio and fermentation time on the growth and enzyme production of recombinant GS115/pPIC9K/rblam16

3 結(jié)論

本研究將來(lái)源于R.barkolensis的昆布多糖酶RbLam16的基因通過(guò)整合到畢赤酵母GS115基因組中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。RbLam16屬于GH16家族，該酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為55 ℃和7.0。相較于已報(bào)道的其他同類酶，RbLam16在45～65 ℃和pH 6.0～7.5范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性和酸堿耐受能力更為出色。因此，該酶在能源開(kāi)發(fā)、食品等領(lǐng)域具有更大的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了GS115/pPIC9K/rblam16的最適培養(yǎng)基pH為6.0、溫度為28 ℃、甲醇添加比例為1.5%(體積分?jǐn)?shù))以及發(fā)酵時(shí)間為120 h；在該條件下，酶活力達(dá)到27.42 U/mL，比初始值提高26.42%。

為進(jìn)一步提高昆布多糖酶RbLam16的活性及穩(wěn)定性并深入了解其催化機(jī)理，后期可對(duì)RbLam16蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；在此基礎(chǔ)上通過(guò)半理性設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行分子改造。此外，后期可在發(fā)酵罐水平通過(guò)高密度發(fā)酵方式進(jìn)一步提高重組菌的產(chǎn)酶能力。在應(yīng)用方面，可以選擇合適的固定化載體對(duì)RbLam16進(jìn)行固定化，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)昆布多糖酶的應(yīng)用潛力。