馬銀花 李萍芳 董文靜 易松望 楊芳 杜波 金晨鐘,*

(1 湖南人文科技學(xué)院 湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)藥無害化應(yīng)用省高校重點實驗室, 湖南 婁底 417000；2 武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 雜交水稻國家重點實驗室, 武漢 430072; *通信聯(lián)系人, E-mail: hnldjcz@sina.com)

水稻（Oryza sativaL.）是世界三大糧食作物之一，世界上超過50%的人口以水稻為主食[1]。水稻約占我國糧食總產(chǎn)量的40%，它的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)是我國糧食安全的重要保證。然而，水稻在生長發(fā)育的各個階段，都會受到各種外界環(huán)境因素的脅迫，其中病原菌和昆蟲就是主要的生物類環(huán)境因素。據(jù)報道，已發(fā)現(xiàn)幾百種昆蟲可以取食水稻。褐飛虱（Nilaparvata lugens）就是其中危害最嚴(yán)重的一類害蟲，從 19 世紀(jì)開始，在我國頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)，可以造成水稻產(chǎn)量的大幅下降[2]，尤其是進(jìn)入 21 世紀(jì)，整個亞洲水稻產(chǎn)區(qū)飛虱暴發(fā)的頻率和規(guī)模有逐漸加大的趨勢[3]，褐飛虱被認(rèn)為是影響水稻生產(chǎn)的最嚴(yán)重的害蟲。據(jù)統(tǒng)計，2008 年我國褐飛虱發(fā)生面積在2500 萬hm2以上[4]，褐飛虱暴發(fā)對水稻生產(chǎn)安全造成巨大威脅[5]。大量使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生產(chǎn)成本增加，甚至導(dǎo)致褐飛虱的“再猖獗”，而培育和種植抗蟲品種才是世界上公認(rèn)的防治病蟲害最經(jīng)濟(jì)、最安全和最有效的手段。

水稻在與昆蟲長期共存的過程中進(jìn)化出了不受昆蟲危害的抗性保護(hù)機(jī)制，而“水稻—褐飛虱”模型被認(rèn)為是一種很好的研究“植物—昆蟲”相互作用和協(xié)同進(jìn)化的模型[6-7]。因此，研究水稻中具有對褐飛虱廣譜抗性基因的抗性機(jī)理及分子防御機(jī)制將促進(jìn)我們對“植物—昆蟲”相互作用的分子機(jī)制的理解，對其基因功能、抗性作用以及防御調(diào)控系統(tǒng)的研究，為抗蟲水稻種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供重要理論指導(dǎo)。

目前，已有30 多個水稻抗褐飛虱基因被鑒定，其中8 個抗褐飛虱基因被克隆，分別是Bph14[8]、Bph9[9]、Bph610]、Bph26[11]、Bph29[12]、Bph18[13]、Bph32[14]和Bph3[15]（Bph15[16]）。隨著多個水稻抗褐飛虱基因的克隆和對其功能的研究，發(fā)現(xiàn)水稻抗褐飛虱基因的組成與植物抗病系統(tǒng)類似[17]，從分子層面來看，同樣是雙層防御機(jī)制：一類是編碼定位于細(xì)胞膜上的受體類激酶，如Bph3和Bph15基因編碼凝集素類受體激酶[15-16]，作為受體識別位于水稻細(xì)胞外的褐飛虱相關(guān)分子，感受褐飛虱取食并啟動抗性反應(yīng)，從而構(gòu)成了水稻防御褐飛虱的第一道屏障（即PTI：PAMPs-triggered immunity），產(chǎn)生包括胼胝質(zhì)沉積，揮發(fā)物的釋放，蛋白酶抑制劑的積累等效應(yīng)。第二類是Bph14、Bph6和Bph9及其等位基因編碼定位于細(xì)胞內(nèi)的NB-LRR 蛋白[8-10]，可能識別褐飛虱分泌進(jìn)入水稻細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)子，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗性反應(yīng)，作為水稻抗褐飛虱的第二道屏障（即ETI：Effector-triggered immunity），可以發(fā)生識別特定效應(yīng)子產(chǎn)生的超敏反應(yīng)以及激素相關(guān)信號的激活等效應(yīng)[6]。Liu 等[15]克隆了Bph3基因，它由 3 個凝集素受體激酶基因(OsLecRK1、OsLecRK2和OsLecRK3)成簇排列構(gòu)成，該基因簇的成員共同作用，調(diào)控水稻對褐飛虱的抗性反應(yīng)，使水稻具有廣譜、持久的抗蟲性[18]。Bph15也是一個對褐飛虱具有高抗性的基因，被定位到標(biāo)記RG1與RG2 之間的47 kb 區(qū)域，從該區(qū)段克隆了編碼一種新型的凝集素受體激酶基因OsLecRK，在水稻抗褐飛虱反應(yīng)中起重要作用；研究表明OsLecRK是個多效性基因，既參與水稻先天免疫反應(yīng)，還在種子萌發(fā)過程中起作用，也參與水稻的發(fā)育過程[19-20]。目前抗褐飛虱基因?qū)?yīng)識別的效應(yīng)子還沒有被找到，而OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3和OsLecRK是如何將褐飛虱的 PAMPs 分子傳遞給下游的機(jī)制也不清楚。作為跨膜的受體胞質(zhì)激酶，它們有可能通過激酶的磷酸化途徑將信號轉(zhuǎn)遞給下游參與免疫反應(yīng)。這些在水稻和褐飛虱的互作過程中都有待進(jìn)一步探索。

OsRRK1(Rop-interacting receptor-like kinase 1)是 Ma 等[21]運用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得的OsLecRK 的互作蛋白，屬于類胞質(zhì)受體激酶RLCKⅥ家族，該基因過量表達(dá)后對褐飛虱的抗性增強(qiáng)，在水稻的發(fā)育和防御中具有多重作用，可用于抗褐飛虱水稻的分子標(biāo)記輔助選擇育種。OsRRK1編碼一個含有392 個氨基酸的蛋白，具有保守的STYKc(serine-threonine/tyrosine-protein kinase catalytic)結(jié)構(gòu)域，屬于RLCK 家族成員，而在水稻中RLCK 可以分為 17 個亞家族[22]。近年來，對 RLCKⅦ家族成員研究的相對比較多，對其他亞家族研究較少，例如 OsRLCK55、OsRLCK185、OsRLCK102、OsRLCK57 、 OsRLCK107 、 OsRLCK118 和OsRLCK176 都是 RLCKⅦ家族成員[23-25]。而進(jìn)化分析結(jié)果表明OsRRK1 屬于RLCKⅥ家族成員，是第一個被進(jìn)行功能分析的RLCKⅥ亞家族基因。對OsRRK1基因功能進(jìn)行深入研究，不僅能深化對RLCKⅥ亞家族的認(rèn)識，對于挖掘新的家族基因并進(jìn)行新基因功能分析具有重要意義。

OsLecRK、OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3作為受體細(xì)胞激酶，在抗褐飛虱的PTI 階段起重要作用，而作為胞質(zhì)受體細(xì)胞激酶的OsRRK1 也在抗褐飛虱中起重要作用。為了探究OsRRK1 在水稻抗褐飛虱機(jī)理，本研究通過酵母雙雜交方法探究OsRRK1 與 OsLecRK（Bph15）、OsLecRK1-3（Bph3）蛋白的關(guān)系，同時利用序列比對和進(jìn)化分析OsLecRK（Bph15）與 OsLecRK1-3（Bph3）幾個蛋白之間的關(guān)系。本研究對研究OsRRK1 在水稻抗褐飛虱的PIT 階段的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 水稻材料和菌株

本研究所用的水稻材料為秈稻B5（含有抗蟲基因Bph14和Bph15）和秈稻Kasalath。B5 是藥用野生稻與栽培稻雜交后代中選育得到的水稻品系；Kasalath 用于擴(kuò)增OsRRK1的開放閱讀框序列。

所使用的菌株包括E. coli菌株TOP10 和酵母菌株AH109，分別由武漢大學(xué)何光存教授實驗室和武漢大學(xué)孫蒙祥教授實驗室提供。

1.2 酵母雙雜交載體構(gòu)建

以B5 的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到OsLecRK的全長，以Kasalath 的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到OsRRK1 的全長。以基因ORF 兩端的18~30 bp 序列，加上相應(yīng)的酶切位點和保護(hù)堿基設(shè)計擴(kuò)增引物(表1)。OsLecRK1-OsLecRK3 的參考序列來源于數(shù)據(jù)庫，以B5 的cDNA 為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增所得的序列與數(shù)據(jù)庫一致。PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物與 pGADT7 和pGBKT7 載體分別進(jìn)行相應(yīng)的酶切反應(yīng)后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物通過熱擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞中，將PCR 鑒定和酶切鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，提取質(zhì)粒后保存于?20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

將 AH109 酵母菌株劃線接種到無抗的 YPDA固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2~3 d；挑取2~3 mm 大小的單菌落接種于5 mL無抗的YPDA液體培養(yǎng)基中，在30℃搖床中，250 r/min 培養(yǎng)過夜。取適量活化的酵母菌轉(zhuǎn)到 100 mL YPDA 中，使 OD 值達(dá)到0.2~0.3，在30℃搖床中，250 r/min 培養(yǎng)3 h，使OD值達(dá)到0.4~0.6。以700g，離心5 min，棄上清。加入30 mL 的無菌水重懸，700g，離心5 min，棄上清。加入 1.5 mL 的 1.1×TE-LiAc（10 mL TE-LiAc含 10×TE 1.1 mL、1 mol/L LiAc 1.1 mL 和無菌水 7.8 mL），轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，13 500 r/min，離心15 s，棄上清，重懸于 400~600 μL 1.1×TE-LiAc 溶液中，至此，感受態(tài)細(xì)胞即制備完成。

表1 用于構(gòu)建載體的引物Table 1. Primers used in vectors constructed.

1.4 酵母與共轉(zhuǎn)化互作驗證

為研究OsRRK1 與OsLecRK 的互作關(guān)系，將OsLecRK 連入 pGADT7 載體，將 OsRRK1 連入pGBKT7 載體，通過共轉(zhuǎn)的方法將它們共轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，待雙缺上的酵母菌長出后（大約3~5 d），隨機(jī)挑選幾組，然后將OD 值調(diào)成10、5、1這三個不同的濃度，點 5 μL 在 SD/-Leu/-Trp/-His三缺（缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸）平板上，3~7 d 觀察菌斑的生長狀況。

為研究OsRRK1 與OsLecRK1-OsLecRK3 互作關(guān)系，將 OsLecRK1-OsLecRK3 連入 pGADT7，OsRRK1 連入pGBKT7，共轉(zhuǎn)化酵母。

Yeastmaker carrier DNA 變性：用1 mL 的移液槍將 Yeastmaker carrier DNA 吸到 200 μL 的小管中。在PCR 儀中95℃~100℃下變性5 min，冰上放置2 min，重復(fù)此過程一次。

反應(yīng)體系構(gòu)建：將Yeastmaker carrier DNA 5 μL、質(zhì)粒DNA 各1 μL（約100 ng）、感受態(tài)細(xì)胞50 μL、PEG-LiAc 溶液 500 μL 依次加入到 1.5 mL離心管中。

將 PEG-LiAc 溶液（10 mL PEG-LiAc 溶液含PEG3350 8 mL, 10×TE 1 mL, 1 mol/L LiAc 溶液 1 mL）30℃下水浴 30 min，再加入 20 μL 二甲基亞砜（DMSO）。42℃下水浴15 min，高速離心15 s，棄上清，重懸于1 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基中。30℃，250 r/min 下?lián)u1 h，高速離心15 s，棄上清，重懸于 1 mL 0.9% NaCl 溶液中，混勻后涂于SD/-Leu/-Trp（缺乏亮氨酸和色氨酸）雙缺平板上。

待雙缺平板上的酵母菌長出后（大約3~5 d），隨機(jī)挑選幾個斑到300 mL 0.9% NaCl 溶液中混勻。將菌液稀釋100 倍測其OD 值。然后根據(jù)OD 值調(diào)成 10、5、1 三個不同的濃度，點 5 μL 在SD/-Leu/-Trp/-His 三缺平板上，3~7 d 內(nèi)觀察菌斑的生長狀況。

1.5 OsLecRK 與 OsLecRK1-OsLecRK3 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測、序列對比與進(jìn)化分析

結(jié)構(gòu)域預(yù)測：利用 SMART 在線分析工具(http://smart.embl.de/)對 OsLecRK、OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3 蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

利用 DNAMAN 分析 OsLecRK、OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3 蛋白的序列。采用鄰位相連法（Neighbor-joining）進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsLecRK 與 OsLecRK1-OsLecRK3 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測、序列比對與進(jìn)化分析

用 SMART 分析 OsLecRK 與 OsLecRK1-OsLecRK3 幾個蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)都屬于B-lectin類受體激酶，都具有 S_TKc（Serine/Threonine protein kinases, catalytic domain）結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)上極其相似（圖1）。

用 DNAMAN 軟件將 OsLecRK 與 OsLecRK1-OsLecRK3 蛋白序列對比分析，結(jié)果表明OsLecRK與OsLecRK1-OsLecRK3 同源性非常高。序列比對結(jié)果如圖2 所示，OsLecRK 與OsLecRK1 的同源性為80.18%，與OsLecRK2 的同源性為53.52%，與OsLecRK3 的同源性為 53.83%，說明BPH15區(qū)間里的OsLecRK與BPH3區(qū)間里的OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3是同源基因或者家族基因。OsLecRK1 與OsLecRK2 的序列比對分析一致性為66.75%，OsLecRK1 與OsLecRK3 的序列比對分析一致性為67.11%，而OsLecRK2 與OsLecRK3 的序列比對分析一致性為 88.78%。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，OsLecRK2 與OsLecRK3 的進(jìn)化關(guān)系更近，因而聚類到一起；OsLecRK 與OsLecRK1 進(jìn)化分析關(guān)系近（圖3）。

2.2 OsRRK1 與OsLecRK 蛋白互作驗證

OsRRK1 與 OsLecRK 連入載體后進(jìn)行共轉(zhuǎn)化酵母實驗結(jié)果表明，pGBKT7-OsRRK1/pGADT7 和pGBKT7/ pGADT7-OsLecRK 在二缺平板上可以正常生長，在三缺平板上不能生長；pGBKT7-Lam/pGADT7-T 陰性對照組在二缺平板上可以正常生長，但是在三缺平板不能生長；pGBKT7-53/pGADT7-T 陽性對照組在二缺平板和三缺平板上均可正常生長，并且在加有X-α-Gal 的三缺平板上可以變藍(lán)；pGBKT7-OsRRK1/pGADT7 -OsLecRK 共轉(zhuǎn)的酵母在二缺平板上正常生長，在三缺平板上可以生長，并且在加有X-α-Gal 的三缺平板上可以變藍(lán)（圖4）。

2.3 OsRRK1 與 OsLecRK1-OsLecRK3 蛋白互作驗證

既然OsRRK1 與OsLecRK 在酵母中存在互作，而OsLecRK 與OsLecRK1-OsLecRK3 具有很高的相似性，那么OsRRK1 與OsLecRK1-OsLecRK3 在酵母中是否存在互作，有待進(jìn)一步驗證。我們將OsRRK1 和OsLecRK1- OsLecRK3 連入載體后進(jìn)行共轉(zhuǎn)化酵母實驗后發(fā)現(xiàn) pGBKT7-OsRRK1/pGADT7-OsLecRK1 共轉(zhuǎn)的酵母在三缺平板上不生長，而pGBKT7-OsRRK1/pGADT7-OsLecRK2 共轉(zhuǎn)的酵母在三缺平板上形成藍(lán)斑，pGBKT7-OsRRK1/pGADT7-OsLecRK3 共轉(zhuǎn)的酵母在三缺平板上形成藍(lán)斑（圖5）。這些結(jié)果表明OsRRK1 與OsLecRK2 和 OsLecRK3 互作，與 OsLecRK2 互作的強(qiáng)度最大，其次是OsLecRK3，與OsLecRK1 不存在互作關(guān)系，推測 OsRRK1 可能參與了OsLecRK2、OsLecRK3 下游的抗性通路。

3 討論

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用是細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的主要組成部分之一，研究其互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對調(diào)控細(xì)胞及其信號有著重要意義。自Fields 等[26]根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點創(chuàng)建酵母雙雜交技術(shù)以來，該技術(shù)以其簡便、靈敏、高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點，在蛋白互作的研究中得到廣泛應(yīng)用。

圖1 OsLecRK與OsLecRK1-OsLecRK3蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 1. Prediction of OsLecRK and OsLecRK1-OsLecRK3 protein domains.

圖2 OsLecRK 與OsLecRK1-OsLecRK3 蛋白序列比對Fig. 2. Alignment of OsLecRK and OsLecRK1-OsLecRK3.

圖3 OsLecRK 與OsLecRK1-OsLecRK3 進(jìn)化分析Fig. 3. Phylogenetic tree analysis of OsLecRK and OsLecRK1-OsLecRK3.

圖4 利用酵母雙雜交對OsRRK1 與OsLecRK 蛋白互作的驗證Fig. 4. The interaction between OsRRK1 and OsLecRK protein was verified by yeast two-hybridization.

植物抗病先天免疫系統(tǒng)是由不同類型的病原分子觸發(fā)的雙分支先天系統(tǒng)[27-29]。水稻抗褐飛虱雙層防御系統(tǒng)第一層是類似于模式識別受體（PRRs）的 LecRKs，該受體通過識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）激活并觸發(fā) PAMP 觸發(fā)免疫（PTI）[28]。而在水稻對昆蟲免疫系統(tǒng)的第一層起作用的受體類細(xì)胞質(zhì)激酶基因OsLecRK、OsLecRK1、OsLecRK2和OsLecRK3可能通過感知食草動物（褐飛虱）相關(guān)分子模式（HAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMP），或介導(dǎo)下游抗性信號事件，從而對BPH侵染的模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)起關(guān)鍵作用，從而使水稻獲得廣譜抗性。

OsRRK1基因表達(dá)量越高對褐飛虱的趨避性越強(qiáng)，而 OsRRK1 與 OsLecRK 互作，OsRRK1很可能是OsLecRK下游抗性通路成員[20]。OsRRK1 與由三種凝集素受體激酶（OsLecRK1-3）組成的抗褐飛虱蛋白 Bph3 中的 OsLecRK2 與 OsLecRK3 互作。在序列比對時發(fā)現(xiàn)，OsLecRK2 與OsLecRK3 的多序列比對一致性最高，達(dá)到了88.78%，說明在抗褐飛虱的PTI 階段，OsRRK1 有可能是通過OsLecRK2與 OsLecRK3 結(jié)構(gòu)域中特殊的氨基酸殘基相互作用，將抗褐飛虱信號傳遞到下游；而OsLecRK1 結(jié)構(gòu)域中可能不存在與OsRRK1相互作用或者存在相互作用效果非常弱的氨基酸殘基。

圖5 OsRRK1 與OsLecRK1-OsLecRK3 蛋白互作的驗證Fig. 5. Confirmation of positive interactions between OsRRK1 and OsLecRK1-OsLecRK3.

亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn) OsLecRK、OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3 定位在質(zhì)膜上，OsRRK1 定位在細(xì)胞質(zhì)中，OsRRK1 有可能被 OsLecRK、OsLecRK2 和 OsLecRK3 磷酸化，而它們可識別HAMP（食草動物相關(guān)分子模式）， 并隨后引發(fā)對褐飛虱的免疫反應(yīng)。OsRRK1 有可能在過量表達(dá)的情況下，通過與OsLecRK2 和OsLecRK3 互作，增強(qiáng)Bph3 的抗性作用，參與抗性表達(dá)。但OsRRK1接受來自細(xì)胞表面的受體激酶的信號并與這些互作蛋白協(xié)同發(fā)揮抗褐飛虱作用的具體分子和細(xì)胞過程有待闡明。

4 結(jié)論

酵母雙雜交結(jié)果顯示 OsRRK1 與 OsLecRK、OsLecRK2 和 OsLecRK3 互作，與 OsLecRK2 互作的強(qiáng)度最大，其次是OsLecRK3，最后是OsLecRK，與OsLecRK1 不存在互作關(guān)系。OsRRK1 能夠通過傳遞受體激酶激活的信號在水稻與褐飛虱互作中發(fā)揮作用，且 OsLecRK 與 OsLecRK1-OsLecRK3同源性非常高。

本研究對于 OsLecRK 介導(dǎo)的對抗褐飛虱的防御機(jī)理和OsLecRK（BPH3 和BPH15）作為模式識別受體被病原菌相關(guān)分子模式激活從而誘發(fā)PTI 機(jī)理提供了一定理論依據(jù)，為后期深入研究OsRRK1與OsLecRK、OsLecRK2 和OsLecRK3 互相作用的位點的結(jié)合位點，說明褐飛虱與水稻之間的分子相互作用，找到影響或抑制蛋白間相互作用的因素，揭示OsRRK1 與水稻間的分子相互作用奠定基礎(chǔ)。