張玨鋒 張琴 李芳 鐘海英 陳建明,*

(1 浙江省農業(yè)科學院 植物保護與微生物研究所， 杭州 310021；2 杭州市林業(yè)科學研究院， 杭州 310021；*通信聯系人，E-mail：chenjm63@163.com)

昆蟲中腸微生物對寄主的繁殖[1]、抵御外來微生物入侵[2]、提高免疫力等均發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，除與害蟲抗性性增強有關的殺蟲劑靶標位點轉移、害蟲解毒酶的高表達以及藥物排泄能力增加之外[3-4]，害蟲中腸微生物可能與寄主抗藥性存在某種關聯。張浩等[5]的研究表明，棉鈴蟲(Helicover pa armigera)腸道菌在蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲過程中對宿主具有保護作用，并檢測到一株能有效降低Bt毒素對寄主殺蟲活性的菌株；點蜂緣蝽(Riptortus pedestris)中腸存在能降解殺螟硫松(Fenitrothion)的Burkholderia屬細菌[6]。去除腸道菌的德國小蠊(Blattella germanica)比敏感品系的抗性水平還低，PCR-DGGE 結果顯示敏感品系與抗性品系的德國小蠊腸道圖譜電泳條帶數量和遷移率存在差異[7-8]。用從小菜蛾(Plutella xylostella)腸道中分離純化的厚壁菌門細菌腸球菌(Enterococussp)、沙門菌(Serratiasp)以及抗生素分別飼喂小菜蛾，腸球菌顯著提高了小菜蛾對毒死蜱的抗性，沙門菌顯著降低了小菜蛾對毒死蜱的抗性，抗生素清除腸道細菌后，小菜蛾的抗藥性顯著增強[9,10]。

二化螟[Chilo suppressalis(Walker)]屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是我國水稻上的重要害蟲。近年，由于耕作制度改變、抗藥性產生等影響，越冬代有效蟲源面積擴大，加劇了二化螟的危害[11,12]。氯蟲苯甲酰胺自2008 年正式注冊以來，在我國被大范圍應用于二化螟的田間防治[13]。然而近年來的研究發(fā)現不同地理種群的二化螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性水平已經存在顯著差異[14-16]，如2017 年報道浙江地區(qū)二化螟種群已對氯蟲苯甲酰胺產生了中高水平的抗性[17]。目前有關二化螟對于氯蟲苯甲酰胺抗性產生機制已有較多研究[18-19]，我們的研究發(fā)現不同抗藥性水平的二化螟種群在中腸微生物群落的組成與結構上存在差異，推測可能與二化螟抗藥性差異有關[20]。為證實二化螟中腸菌群在寄主對氯蟲苯甲酰胺抗性產生過程中的作用，本研究采用宏基因組測序以及傳統微生物分離純培養(yǎng)的方法研究不同濃度氯蟲苯甲酰胺處理的二化螟種群中腸細菌類微生物多樣性，以期為闡明二化螟對氯蟲苯甲酰胺產生抗藥性的機理以及預防和治理二化螟的抗藥性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與藥劑

供試二化螟蟲源采集于浙江海寧田間，對氯蟲苯甲酰胺抗性倍數為 52.72，飼養(yǎng)于浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所人工氣候室內，溫度為28℃±0.5℃；光周期為16 h 光照/8 h 黑暗；長期茭白飼喂，4 齡幼蟲用于試驗。

供試藥劑為95%氯蟲苯甲酰胺原藥。

1.2 實驗方法

藥劑配置：氯蟲苯甲酰胺原藥溶于二甲基亞砜，配置成 100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 溶液，0.23 μm 濾頭過濾后備用，以二甲基亞砜溶液為對照。

試蟲處理：45 日齡水稻苗分株洗凈，晾干，對照及上述3 種濃度溶液浸泡30 s 后分別放入罐頭瓶中，根部包裹紗布并保濕，每瓶中接入4 齡二化螟幼蟲20 頭，每濃度處理200 頭蟲子，24 h、48 h、72 h 后取樣，每次取樣30 頭4 齡二化螟幼蟲，其中100 μg/mL 氯蟲苯甲酰胺溶液24 h、48 h 和72 h處理命名為 100_24h、100_48h、100_72h；200 μg/mL氯蟲苯甲酰胺溶液24 h、48 h 和72 h 處理命名為200_24h、200_48h、200_72h；400 μg/mL 氯蟲苯甲酰胺溶液24 h、48 h 和72 h 處理命名為400_24h、400_48h、400_72h；二甲基亞砜溶液24 h、48 h 和72 h 處理命名為 CK_24h、CK_48h、CK_72h，并解剖取中腸用于下一步實驗。

中腸細菌 DNA 的提?。憾心c去除內含物之后無菌水漂洗，細菌 DNA 提取試劑盒(OMEGA , USA )提取中腸細菌類微生物DNA。

Illumina PE250 測序：中腸細菌類微生物DNA檢測質量稀釋后作為模板，根據測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物，PCR 擴增(表1)之后割膠回收產物?；厥?DNA 片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另外一個引物互補，形成“橋 (bridge)”產生 DNA 簇；DNA 擴增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3'端黏性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA 片段的序列。Illumina PE250 測序得到的雙末端讀長(PE reads)首先進行拼接、質控和過濾，區(qū)分樣本后進行 OTU 聚類分析和物種分類學分析，對優(yōu)化序列提取非重復序列，降低分析中間過程冗余計算量，去除沒有重復的單序列，按照 97% 相似性對非重復序列(不含單序列) 進行OTU 聚類，基于OTU 聚類分析結果，可以對 OTU 進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。在上述分析的基礎上，可以進行一系列群落結構和系統發(fā)育等深入的統計學和可視化分析。

二化螟中腸分離：供試二化螟4 齡幼蟲20 頭，分為4 組，分別解取中腸后75%酒精清洗、勻漿后加入10 mL ddH2O 稀釋，用于進一步實驗。

LB 固體培養(yǎng)基配制：950 mL ddH2O 加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，加熱融解后分裝，調pH 至7.0，ddH2O 定容至1 L，高壓蒸汽滅菌21 min 后取出待用。

表1 不同處理二化螟試蟲中腸細菌群落多樣性指數Table 1. Bacterial community richness, diversity indices of midgut in Chilo suppressalis under different treatments.

二化螟中腸細菌類微生物的培養(yǎng)：在1 mL 中腸研磨液中分別加入1 mL 上述3 個濃度氯蟲苯甲酰胺溶液和9 mL LB 固體培養(yǎng)基混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個濃度3 個重復，以ddH2O 為對照處理。48 h 后用牙簽挑取培養(yǎng)菌落，每個濃度挑取30 個菌斑，置于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)后離心收集菌體提取DNA。

基因組DNA 的提?。杭毦鶧NA 的提取采用細菌DNA 提取試劑盒(OMEGA，USA)進行，提取的DNA 用于進一步 PCR，PCR 參考張玨鋒等[20]，PCR產物送北京擎科生物科技有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 不同處理二化螟體內細菌群落多樣性分析

本次測序的二化螟中腸所有 12 個樣品，測序深度均在99.00%以上，能夠代表各個樣本中腸細菌種群的真實情況(表1)。Chao 指數與Ace 指數通常用于描述細菌群落多樣性，兩者都可用來估計群落中含有OTU 數目的指數，表1 中，對照24 h 處理(CK_24h)的指數(Chao、Ace)平均值最高，為 1123和3.91；200_48h 處理的Ace 平均值為12 個測序樣品中最低(415)。辛普森指數與香農指數也用于描述群落多樣性，前者指數值越大，說明群落多樣性越低，后者值越大，說明群落多樣性越高。表1 結果顯示，CK_24h 處理辛普森指數最低，同樣該處理香農指數最高。

2.2 OTUs 統計及分類學分析

圖1 不同處理二化螟試蟲中腸細菌類微生物OUT韋恩圖分析Fig. 1. Venn analysis of the number and community of intestinal bacteria of Chilo suppressalis under different treatments.

圖2 基于屬水平不同處理二化螟體內中腸細菌群落結構Fig. 2. Genera of intestinal bacteria found in different treated Chilo suppressalis population.

由韋恩圖(圖1)分析結果可知：對照二化螟試蟲中腸細菌類微生物群落OTUs 為1346 個，多于氯蟲苯甲酰胺處理的二化螟試蟲，氯蟲苯甲酰胺100、200、400 μg/mL 處理種群中腸細菌類微生物群落OTUs 分別為 748 個、813 個、875 個。3 個不同濃度氯蟲苯甲酰胺處理的二化螟種群中特有的 OUT數量分別為 29(100 μg/mL)、71(200 μg/mL)、57(400μg/mL)，均小于對照處理的410。

2.3 不同處理二化螟中腸細菌群落結構分析

由圖2 可知，對相似水平達 97%的OTU 代表序列進行分類學分析，從而得到不同樣品中每個OTU 對應的物種分類信息。在屬的分類水平上，注釋到明確分類地位的有29 個屬(圖2)。在對照二化螟種群中腸微生物中比例較高的擬桿菌屬(Bacteroides)在處理種群中有所降低，在 100_72h中的比例較高但也僅為8.16%；但腸道致病菌摩根氏菌屬(Morganella)與普羅威登斯菌屬(Providencia)的比例顯著升高，前者從CK_24h 的3.48%上升至100_24h 的36.84%，200_24h 的55.10%和400_24h的19.09%；后者在對照種群中的3 個時間段的含量分別為4.40%、5.80%和0.50%，而在處理種群中的最高比例達到 35.16%(100_48h)，即使在相對含量較低的400_48h 處理中，比例也達到3.17%，高于對照處理中的0.50%。推測氯蟲苯甲酰胺的施用會對二化螟中腸內某些細菌類微生物比例及優(yōu)勢度造成影響。變形菌屬(Proteus)在對照種群 3 個時間段內的含量均較低，而在處理種群內含量相對較高。

2.4 COG 數據庫對比

16S rRNA 功能預測是通過PICRUSt 對OUT豐度表進行標準化，對應Greengene ID 獲得OUT對應的COG 家族信息和KO 信息及其豐度，并預測基因進行COG 功能分類，結果如圖3 所示。對照種群24 h 處理 (CK_24h) 染色質結構與動力學相關 (Chromatin structure and dynamics) 基因數為 11 452，高于100 μg/mL、200 μg/mL 及 400 μg/mL氯蟲苯甲酰胺 24 h 處理種群(100_24h、200_24h、400_24h)的1274、1355 與1737；同樣對照種群24 h處理 (CK_24h) 的防御機制 (Defense mechanisms)相關基因數1 058 083 也高于其余3 個處理種群的872 261、639 857 及732 004。除此之外，4 個種群在其余各功能分類基因數量上并無差異。

圖3 不同處理二化螟試蟲COG 功能預測Fig. 3. COG classification of intestinal bacteria of Chilo suppressalis in different treatments.

2.5 KEGG 分析結果

由KEGG 的功能預測結果可見，對照種群各個時間段的結果與處理試蟲的結果無明顯差異，主要集中于膜轉運(membrane transport)、碳代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、復制與修復(replication and repair)，其中膜轉運(membrane transport)的相對豐度在氯蟲苯甲酰胺處理中均為 0.16，略高于 3 個對照的均值0.1。

2.6 氯蟲苯甲酰胺誘導培養(yǎng)二化螟中腸細菌測序結果

由表2 可知，在含有不同濃度氯蟲苯甲酰胺溶液的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的二化螟中腸細菌類微生物種類存在差異，對照處理測序成功的 19 株菌株，除去Leclercia adecarboxylata，其余均屬腸桿菌屬(Enterobacter)；100 μg/mL 處理測序成功的 26 株菌株中除 3 株無法培養(yǎng)外(uncultured bacterium)，18株屬腸桿菌屬(Enterobacter)，另有Lelliottia nimipressuralis、Klebsiellasp.、Enterobacter kobei、Leclercia adecarboxylata、Pantoea agglomerans和Pantoeasp. DAP16 等 5 株菌株；200 μg/mL 處理中除 13 株屬腸桿菌屬(Enterobacter)外，其余菌株與100 μg/mL 一致；400 μg/mL 中除Enterobacter外，另 檢 測 到Leclercia adecarboxylata、Pantoea agglomerans及Pantoeasp. DAP16 三種菌與 100μg/mL 及 200 μg/mL 培養(yǎng)結果略有差異。

3 討論

本研究中氯蟲苯甲酰胺溶液不同濃度處理能降低二化螟中腸細菌類微生物豐度及多樣性，處理種群中腸細菌類微生物的OUT 數值、特有OUT 數值均低于未處理種群。推測由于昆蟲腸道微生物的群落結構組成易受食物、生存環(huán)境、腸道理化因子以及免疫系統等諸多因素的影響[17]，因而外源氯蟲苯甲酰胺的處理致使二化螟中腸微生物的群落結構發(fā)生變化。已有研究表明，昆蟲腸道菌群結構豐度與寄主對化學殺蟲劑的抗性存在某種關聯，如棉鈴蟲抗性種群的中腸細菌類微生物的豐富度顯著高于敏感種群[21]；而夏曉峰[10]的研究發(fā)現利用抗生素清除腸道細菌后，小菜蛾(Plutella xylostella)的抗藥性反而得到顯著增強。因而進一步推測，本研究中處理種群細菌類微生物群落結構豐度降低等可能與寄主昆蟲對氯蟲苯甲酰胺抗性的產生存在關聯。而對照處理的3 個時間段之間基于屬水平細菌菌群落結構存在一定差異，推測與二化螟齡期轉變及增長有關[22]。

昆蟲腸道微生物對于宿主有著重要作用，其菌群結構、組成、豐度以及功能的改變均為抵御和消除外源因子對于昆蟲生長發(fā)育與繁殖等的影響[23,24]。隨著化學殺蟲劑的廣泛應用，相應的害蟲對殺蟲劑抗性問題也日益嚴重。多項研究表明，某些昆蟲的共生細菌具有降解化學殺蟲劑的能力[25,26]，這表明昆蟲的共生細菌有可能與寄主抗藥性的產生有關。果蠅腸道菌(Bactrocera dorsalis)可提高寄主對敵百蟲(trichlorphon)的抗性[27]；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SWL-19 能明顯減輕氟對家蠶的脅迫[28]。劉金萍等[29]通過 KEGG 代謝途徑分析，推測高濃度CO2脅迫下，棉鈴蟲中腸微生物具有降解有毒物質作用。氯蟲苯甲酰胺的施用致使宿主通過其菌群結構、組成及功能的改變消除其造成的不良影響，從而導致本研究中摩根氏菌屬(Morganella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)以及變形菌屬(Proteus)在處理種群中的比例顯著升高；培養(yǎng)結果顯示氯蟲苯甲酰胺處理獲得的培養(yǎng)菌株除腸桿菌屬外，還存在Lelliottia nimipressuralis、Klebsiella sp.、Enterobacter kobei、Leclercia adecarboxylata、Pantoea agglomerans等多種其他菌屬。由此推測，二化螟腸道內細菌類微生物對氯蟲苯甲酰胺的敏感性存在差異；同時離體培養(yǎng)結果也說明氯蟲苯甲酰胺脅迫致使二化螟中腸內某些特定功能的細菌類微生物比例及優(yōu)勢度發(fā)生改變。

圖4 基于宏基因組測序KEGG 功能預測Fig. 4. KEGG function prediction based on macrogenomic sequencing.

表2 二化螟中腸細菌類微生物離體培養(yǎng)測序結果Table 2. Isolation and identification of bacteria from the midgut of Chilo suppressalis.

自然環(huán)境中的微生物群落功能組成與環(huán)境因子密切相關，相似環(huán)境中的微生物群落功能更相似，而行使功能的微生物物種組成可能差異較大[30、31]。因而除了不同環(huán)境中的微生物群落結構組成之外，揭示微生物群落功能更為重要。本研究中根據16S測序數據進行基于KEGG和eggNOG數據庫的功能預測，結果發(fā)現不同濃度氯蟲苯甲酰胺處理二化螟種群與對照種群在各功能分類基因數量及豐度上無明顯差異，推測由于本研究中氯蟲苯甲酰胺處理最長時間僅72 h，外源化學殺蟲劑脅迫時間過短，不足以使二化螟中腸微生物群落功能發(fā)生改變，處理時間的延長是否會使群落功能發(fā)生變化還需進一步實驗驗證。

總之腸道微生物與寄主昆蟲協同發(fā)展的過程中，通過何種機制抵御外源不良因子的脅迫，調節(jié)維持腸道微生物群落結構、豐度、功能來維持菌群的穩(wěn)態(tài)平衡，維護寄主昆蟲的利益目前還不明確，需進一步研究。