朱蘭蘭，侯鐘令，崔亞菲，苗鈞魁，冷凱良*

1(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博，255000)2(青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗室，山東 青島，266237) 3(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島，266071)4(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

南極磷蝦作為戰(zhàn)略性新興資源，營養(yǎng)價值和應(yīng)用潛力巨大。研究表明，磷蝦粉粗蛋白含量為60%～65%[1-3]，粗脂肪含量為15%左右[2, 4]，灰分含量在6%～13%[2, 4]。全沁果等[2]對南極磷蝦粉的營養(yǎng)成分分析表明：磷蝦粉含粗蛋白質(zhì)61.38%、粗脂肪14.49%、甲殼素6.08%、灰分6.27%，南極磷蝦粉中總氨基酸含量為473.40 mg/g，其中，∑EAA/∑AA=38.74%，∑DAA/∑AA=44.61%，符合FAO/WHO認(rèn)可的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。同時，F(xiàn)RBER-LORDA等[5]證實(shí)，南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中必需氨基酸占氨基酸總量的45%左右，符合FAO/WHO/UNU1985推薦的成年人對蛋白質(zhì)的攝取需求。

酶解是南極磷蝦蛋白資源高效利用的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。酶作用下，南極磷蝦大分子蛋白質(zhì)和脂肪被分解為肽、氨基酸、脂肪酸等，一方面對南極磷蝦的營養(yǎng)和風(fēng)味特性具有積極的貢獻(xiàn)作用；另一方面，酶解產(chǎn)物同樣可作為功能肽、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、調(diào)味品等高值產(chǎn)品的重要基料。綜上，對南極磷蝦酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，可為南極磷蝦蛋白質(zhì)資源的高值化利用提供技術(shù)支持。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種基于誤差逆向傳播算法進(jìn)行訓(xùn)練的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[6]。核心思想在于自變量輸入后經(jīng)神經(jīng)元迭代得到輸出值。目前，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)主要應(yīng)用于食品風(fēng)險評估[7-8]、食品工藝優(yōu)化[9-10]、食品功能分析[11-12]等領(lǐng)域。相比傳統(tǒng)工藝優(yōu)化研究的響應(yīng)面法而言，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有以下優(yōu)勢：

本研究以水解度為衡量指標(biāo)，研究多因素(酶添加量、pH、酶解時間、溫度)作用下的南極磷蝦酶解工藝條件，應(yīng)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立酶解工藝擬合模型，并借助模型篩選、驗證最佳酶解工藝參數(shù)，同時為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在食品工藝優(yōu)化相關(guān)研究中的應(yīng)用做出有益探索，也為食品工藝優(yōu)化過程提出新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦：購自遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，-80 ℃貯藏直至分析。

木瓜蛋白酶，北京索萊寶生物科技有限公司；硫酸銅，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖液，奧豪斯(上海)儀器有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C020型組織搗碎機(jī)，九陽股份有限公司；CT14D型高速臺式離心機(jī)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；STARTER 3C 型pH計，奧豪斯(上海)儀器有限公司；78-1型磁力攪拌器，常州國華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 酶解工藝參數(shù)的選擇

根據(jù)相關(guān)報道[15-17]中常采用的研究思路，選用木瓜蛋白酶酶解南極磷蝦，選擇酶添加量、pH、酶解時間、酶解溫度4個參數(shù)作為酶解工藝主要影響因素進(jìn)行工藝研究，各參數(shù)值如表1所示。

表1 酶解反應(yīng)的各個指標(biāo)及水平Table 1 Factors and le els of enzymatic hydrolysis process

在保證因素和水平的組合具有代表性的前提下，借助中心組合設(shè)計的思想，設(shè)定如表2所示的實(shí)驗組。每個實(shí)驗組進(jìn)行3次平行。

表2 不同參數(shù)下南極磷蝦的水解度Table 2 Degree of hydrolysis of Antarctic krill under different parameters

1.3.2 酶解工藝流程

酶解工藝如圖1所示。

圖1 酶解反應(yīng)工藝流程Fig.1 Process of the enzymatic hydrolysis

1.3.3 水解度的測定

蛋白質(zhì)在酶促反應(yīng)過程中，肽鍵斷裂的比例可以表征底物在該次反應(yīng)中水解的程度。目前常用水解度(degree of hydrolysis，DH)表征這一指標(biāo)，通過酶解液中游離氨基酸態(tài)氮含量與底物中的總氮含量之比計算：

(1)

式中：Nf,游離氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，mg/mL，使用甲醛電位滴定法[18]測定；, 酶解液體積,mL；N,總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù),mg/g，使用凱氏定氮法[19]測定；m,樣品質(zhì)量,g。

1.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

1.4.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建

擬構(gòu)建的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型如圖2所示。典型的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型由輸入層、隱藏層和輸出層構(gòu)成。輸入層和輸出層即自變量的輸入值和因變量的輸出值。某一隱藏層神經(jīng)元接收了加權(quán)的輸入值后，經(jīng)過激活函數(shù)HN的運(yùn)算，再經(jīng)過輸出層加權(quán)后傳遞給輸出神經(jīng)元。輸出神經(jīng)元“收集”每一加權(quán)了的隱藏神經(jīng)元傳遞過來的值，加和之后即得到最終的輸出值。

圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型示意圖Fig.2 Schematic diagram of BP neural network model

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的核心在于隱藏層和輸出層的權(quán)重，建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的核心問題即這兩組權(quán)重的確定。這一過程往往被描述為“訓(xùn)練”或“監(jiān)督學(xué)習(xí)”。即，給定2組初始權(quán)重，代入已知的自變量(酶解參數(shù))得到1個輸出值，再將該輸出值和已知的因變量實(shí)際值(水解度)對比，并對權(quán)重做出調(diào)整。由自變量得到預(yù)測值的過程稱為“正向傳播”，而由預(yù)測值和實(shí)際值的對比從而對權(quán)重進(jìn)行更新的過程稱為“反向傳播”。一次正向傳播+一次反向傳播稱為一次迭代。通過反復(fù)的迭代，可以使得神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值逐步接近實(shí)際值。反向傳播過程中對權(quán)重的更新依賴于誤差函數(shù)和“梯度下降”方法，相關(guān)數(shù)學(xué)證明涉及偏微分、矩陣運(yùn)算等，較為繁瑣冗長，且均已有完備的推導(dǎo)過程(相關(guān)內(nèi)容文中省略)。

本研究所建立的模型中，網(wǎng)絡(luò)的輸入層由酶添加量、pH、酶解時間、酶解溫度4個自變量構(gòu)成，輸出層由因變量水解度構(gòu)成，隱藏層神經(jīng)元個數(shù)根據(jù)試驗判定最優(yōu)值。該模型的激活函數(shù)選擇BP網(wǎng)絡(luò)最常用的Sigmoid函數(shù)，即構(gòu)成了4×n×1的3層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理和模型訓(xùn)練

水解度數(shù)據(jù)使用Excel 2019進(jìn)行整理，使用MATLAB 2019a軟件進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的搭建和訓(xùn)練。

訓(xùn)練所用數(shù)據(jù)共29×3=87組，隨機(jī)抽取10%的數(shù)據(jù)(9組)驗證模型正確率，其余數(shù)據(jù)78個用于訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度實(shí)驗結(jié)果

各參數(shù)下南極磷蝦的水解度如表2所示。29組實(shí)驗，每組重復(fù)3次，共計87個水解度實(shí)驗數(shù)據(jù)，用于之后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建。

2.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

2.2.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型參數(shù)

使用MATLAB 2019a軟件中的Neural Net Fitting工具箱進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和訓(xùn)練。經(jīng)該工具箱對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的過程中，每一epoch(迭代次數(shù))中訓(xùn)練數(shù)據(jù)集被以70%、15%、15%隨機(jī)劃分為訓(xùn)練部分、驗證部分和測試部分進(jìn)行迭代訓(xùn)練。經(jīng)建模預(yù)實(shí)驗，隱藏層神經(jīng)元個數(shù)選擇為15個，學(xué)習(xí)率為0.02時，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型表現(xiàn)較佳。由于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)優(yōu)化過程主要涉及到并依賴于較為晦澀的數(shù)學(xué)推導(dǎo)和計算機(jī)程序進(jìn)行預(yù)實(shí)驗和調(diào)整，文中未予以贅述。

常用均方誤差函數(shù)(mean squared error，MSE)表征BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和期望值之間的誤差如公式(2)所示：

(2)

本研究中，即通過每個樣本(每組實(shí)驗)的期望值(實(shí)驗中實(shí)測的水解度)，和輸入自變量后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型給出的輸出值(預(yù)測值)，來評價神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在預(yù)測酶解反應(yīng)結(jié)果時的精確度。

同時，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值和對應(yīng)的期望值越接近，則神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)性能越好。則若以輸出值為橫坐標(biāo)，期望值為縱坐標(biāo)，每一樣本對應(yīng)的數(shù)據(jù)點(diǎn)應(yīng)盡可能接近于直線y=x。即兩者是線性相關(guān)的。那么，線性相關(guān)中常用的相關(guān)系數(shù)R2或者R同樣可以評估神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的性能。

2.2.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的MSE評估

通過MSE評估所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)MSE評估標(biāo)準(zhǔn)，MSE<0.01時，模型構(gòu)建成功，準(zhǔn)確性達(dá)到擬合要求。由圖3可知，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型經(jīng)83次迭代后達(dá)到最小MSE值0.002 242，模型構(gòu)建成功，擬合準(zhǔn)確性高，可用于南極磷蝦酶解工藝的擬合研究。

圖3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的MSE指標(biāo)Fig.3 MSE index of BP neural network model

2.2.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相關(guān)系數(shù)評估

統(tǒng)計訓(xùn)練、驗證、測試和全部數(shù)據(jù)的輸出值和目標(biāo)值，并計算對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)如圖4所示。

各組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)R如圖4所示，期望(目標(biāo))值和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的輸出值呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步驗證了該BP神經(jīng)模型模型構(gòu)建成功，擬合準(zhǔn)確性高。

圖4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相關(guān)系數(shù)指標(biāo)Fig.4 Correlation coefficient index of BP neural network model

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型性能測試

使用所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，對隨機(jī)選出的9組檢驗集數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。實(shí)驗測定的水解度和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的水解度進(jìn)行結(jié)果對比，如圖5所示。

由圖5可知，實(shí)驗測定得到的水解度(期望值)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所給出的輸出值(預(yù)測值)具有一致的變化趨勢。同時計算可知，該9組數(shù)據(jù)的MSE=0.038 89，R=0.985 6，表明所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型給出的預(yù)測值是準(zhǔn)確的。

圖5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的性能驗證Fig.5 Performance erification of BP neural network model

2.4 最優(yōu)酶解工藝條件篩選

南極磷蝦酶解工藝已有多位學(xué)者研究報道過，但研究結(jié)果存在較大偏差。張華丹[15]等選擇了堿性蛋白酶對南極磷蝦酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解時間5.47 h、pH為8.08時南極磷蝦蛋白粉水解度可達(dá)到15.27%；劉璐等[21]發(fā)現(xiàn)pH 8.5，溫度55 ℃，加酶量2.6%，酶解時間5 h,下南極磷蝦分解度為(23.85±0.95)%；燕夢雅等[22]同樣采用木瓜蛋白酶對南極磷蝦進(jìn)行水解發(fā)現(xiàn)，酶與底物質(zhì)量比為比0.25%，酶解30 min，溫度55 ℃， pH 6.0時酶解產(chǎn)物的溶解度最大為(12.06±0.21)%。造成結(jié)果偏差的原因一方面是原料性質(zhì)差異導(dǎo)致，而模型擬合的不準(zhǔn)確性也是重要原因。

借助BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型“梯度下降”的思想，進(jìn)行實(shí)驗參數(shù)的極值預(yù)測，與響應(yīng)面數(shù)據(jù)處理相比，避免了舍去高次交互項所帶來的誤差，其對實(shí)驗參數(shù)的預(yù)測更加準(zhǔn)確。具體做法為：以三維坐標(biāo)系的二元函數(shù)為例：考慮z=f(x,y)，其圖像為空間直角坐標(biāo)系中的曲面。若移動x和y的位置，則z值將會對應(yīng)地增大或者減小；數(shù)學(xué)上，將z值增大或縮小“最快”的“移動方向”定義為梯度。若主動地將點(diǎn)(x0,y0)沿該點(diǎn)的梯度移動特定距離至(x1,y1)，再將點(diǎn)(x1,y1)沿該點(diǎn)的梯度移動特定距離至(x2,y2)……反復(fù)進(jìn)行該操作，則點(diǎn)的位置將逐漸逼近函數(shù)的極大/小值。

本研究建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可視作酶添加量、pH、時間和溫度為自變量的四元函數(shù)，在五維坐標(biāo)系中使用“梯度下降”思想求得該模型衡量指標(biāo)水解度的極大值。實(shí)際操作則通過MATLAB編寫程序?qū)崿F(xiàn)。

經(jīng)過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型擬合，根據(jù)水解度值大小篩選，得到水解度值(大于40%)的處理方案4組，結(jié)果如表3所示。

表3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化所得的極大值Table 3 Maximum alues obtained by neural network model optimization

在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型求解的極值中，極值點(diǎn)均為數(shù)學(xué)角度獲得，需要結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況進(jìn)行工藝參數(shù)的選擇。方案3所給出的條件中，溫度97.21 ℃顯然遠(yuǎn)超木瓜蛋白酶的最適溫度，該方案應(yīng)舍去；方案4的反應(yīng)時間大大長于其他幾種,但水解度不具有顯著優(yōu)勢且酶添加量亦無顯著降低，予以舍去；方案1相對于方案2，酶添加量和反應(yīng)時間有大幅度增加,但水解度并未顯著升高，從生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)價值角度考慮，同樣予以舍去。綜上，選取方案2做為最終的優(yōu)化結(jié)果。

結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況，采用酶添加量4.73%、pH 6.99、溫度 54.0 ℃、時間201.0 min進(jìn)行酶解工藝操作，得到南極磷蝦水解度為41.20%，與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測值41.36%無顯著差異。本研究所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型能夠準(zhǔn)確地對南極磷蝦酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究以南極磷蝦酶解反應(yīng)的水解度為考查指標(biāo)，以酶添加量、酶解時間、pH和酶解溫度為自變量，建立了基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的南極磷蝦酶解工藝模型，并借助模型對南極磷蝦酶解工藝最佳參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

首先，使用78個樣本對該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行83次迭代后，MSE達(dá)到最小值0.002 242，所有樣本相關(guān)系數(shù)達(dá)到最大值0.956 9，表明南極磷蝦酶解反應(yīng)可以采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模型對反應(yīng)過程進(jìn)行擬合和預(yù)測，且該模型的準(zhǔn)確度達(dá)到了具有應(yīng)用價值的標(biāo)準(zhǔn)。

隨后，使用9個樣本對模型進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，該9組數(shù)據(jù)的MSE=0.038 89，R=0.985 6。表明該模型對南極磷蝦酶解反應(yīng)的預(yù)測良好。

最終，采用“梯度下降”思想求解BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中水解度的極大值，并從經(jīng)濟(jì)和效率角度綜合分析得最優(yōu)條件為酶添加量4.73%,pH 6.99,溫度 54.0 ℃,時間201.0 min。經(jīng)實(shí)驗驗證，該酶解條件下所得的南極磷蝦水解度為41.20%，與預(yù)測值41.36%無顯著差異。

本研究所建立的基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的南極磷蝦酶解工藝模型能夠較好地對南極磷蝦酶解反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，研究結(jié)果將為南極磷蝦酶解工藝的優(yōu)化提供了新的研究思路和技術(shù)參考。相比響應(yīng)面處理，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有偏差性更小、準(zhǔn)確性更好等優(yōu)勢，可在食品相關(guān)研究領(lǐng)域中進(jìn)行廣泛應(yīng)用。在食品生產(chǎn)工藝優(yōu)化過程中，若使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，還應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：

首先，基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模型建立依賴于足夠數(shù)量的樣本，對于特定問題而言樣本數(shù)目不應(yīng)低于某個下限。其次，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立的過程中，相關(guān)重要參數(shù)，如學(xué)習(xí)率、激活函數(shù)、誤差函數(shù)、隱藏神經(jīng)元個數(shù)等的選取至關(guān)重要。具體操作過程中，這些參數(shù)的選取和設(shè)置也一定程度上依賴于經(jīng)驗參數(shù)的選取和預(yù)實(shí)驗的結(jié)果。同時，在BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化生產(chǎn)工藝時，前期單因素實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性尤為重要。此外，在解決食品領(lǐng)域中具體問題時，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相關(guān)評估指標(biāo)還需要進(jìn)一步的研究和數(shù)據(jù)積累。

隨著計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型為代表的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)將會擁有廣闊的發(fā)展前景，在此背景下，應(yīng)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化南極磷蝦酶解工藝的研究，可為南極磷蝦蛋白質(zhì)資源的開發(fā)和高值化利用提供技術(shù)支持，相關(guān)研究也將為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)借鑒。