周秋利，顧喆，龍凌鳳，郭書賢，劉汝寬，孫海彥，孫付保*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽，473004) 3(湖南省林業(yè)科學(xué)院 省部共建木本油料資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙，410004) 4(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所海南省熱帶微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口，571101)

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂，是微生物在一定條件下產(chǎn)生并儲存在細(xì)胞內(nèi)的甘油酯，其脂肪酸組成與植物油脂類似，以C16和C18系脂肪酸為主，可以作為生產(chǎn)生物柴油的原料[1]。由于產(chǎn)油微生物具有發(fā)酵周期短、不受季節(jié)氣候影響和碳源利用廣等優(yōu)點(diǎn)，在未來生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]，具有良好的發(fā)展前景。細(xì)菌、酵母、霉菌和藻類都可以用來生產(chǎn)微生物油脂，其中以酵母和霉菌類真核微生物居多[3]，一些產(chǎn)油酵母的油脂質(zhì)量可以達(dá)到自身干重的80%[4]。

目前，微生物油脂的生產(chǎn)價(jià)格仍高于動(dòng)植物油，主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中碳源(主要是葡萄糖)成本占總成本的80%[5]，因此要實(shí)現(xiàn)微生物油脂的大規(guī)模生產(chǎn)必須使用廉價(jià)的碳源。木質(zhì)纖維素是世界上儲量最大的可再生資源，充分水解后能得到含有葡萄糖和木糖等單糖的混合糖[6]，是實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化、生產(chǎn)生物產(chǎn)品的潛在重要原料。然而，大多數(shù)微生物具有葡萄糖效應(yīng)，通常先消耗葡萄糖后利用其他戊糖，葡萄糖會抑制其他糖的利用[7]，這種效應(yīng)造成木糖資源浪費(fèi)。因此，選育能同時(shí)利用葡萄糖和木糖混合糖的高產(chǎn)油脂酵母已經(jīng)成為微生物油脂技術(shù)領(lǐng)域的重要研究方向。

傳統(tǒng)誘變方法是實(shí)現(xiàn)菌株改良的有效方法之一[8]，與單一誘變方法相比，物理化學(xué)復(fù)合誘變有更高的突變頻率[9]。常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)誘變育種技術(shù)是利用等離子體射流破壞細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞啟動(dòng)自身的DNA修復(fù)機(jī)制，在此過程中會產(chǎn)生基因突變[10]。該技術(shù)產(chǎn)生的等離子體濃度高且均勻，具有突變率高、成本低、無污染和操作安全等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母和真菌等多種微生物育種[11]，比如小球藻Chlorellaulgaris，ARTP誘變后選育出的高產(chǎn)菌株M1，其總脂含量提高了103.5%[12]；酵母Candidatropicali，ARTP誘變后選育出的突變菌株T31，其木糖醇產(chǎn)量增加了22%[13]。硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)是一種烷化劑，能夠使部分堿基烷基化，從而改變DNA結(jié)構(gòu)，常用于真核微生物的誘變育種[14]。袁超等[15]利用DES和紫外線進(jìn)行物理化學(xué)復(fù)合誘變，篩選出1株高產(chǎn)糖化酶的菌株，其產(chǎn)酶能力提高了53%。綜上所述，利用ARTP和DES復(fù)合誘變有望大大提高菌株的產(chǎn)油能力。此外，建立快速高效的篩選方法是選育高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵。唐鑫等[16]利用脂肪酸合酶抑制劑淺藍(lán)菌素和表征脂肪酸脫氫酶活性的氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)為篩選因子，篩選出高產(chǎn)花生四烯酸的高山被孢霉。金麗華等[17]基于尼羅紅熒光染色測定油脂方法，利用96孔板高通量篩選手段獲得經(jīng)ARTP誘變的高產(chǎn)突變體。由此可以利用淺藍(lán)菌素和TTC對突變菌株進(jìn)行初篩，再利用尼羅紅熒光染色和孔板培養(yǎng)進(jìn)行高通量篩選。

因此，本文利用ARTP和DES誘變技術(shù)對可同時(shí)利用葡萄糖和木糖混合糖的野生油脂酵母TrichosporondermatisZZ-46進(jìn)行復(fù)合誘變處理，以一定濃度的淺藍(lán)菌素和TTC作為篩選因子對突變體進(jìn)行初篩，再利用尼羅紅熒光檢測對初篩突變菌株進(jìn)行高通量篩選，以期獲得高產(chǎn)油脂酵母，為后續(xù)利用纖維素水解液發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

T.dermatisZZ-46, 南陽市工業(yè)微生物菌種保藏中心,菌株編號NICC 30027。

1.1.2 主要試劑

淺藍(lán)菌素,Sigma公司;氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC),生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

常壓室溫等離子體誘變儀ARTP-3，北京思清源生物科技有限公司；GC-2030AF氣相色譜儀，日本島津；Chromaster CM5110高效液相色譜儀，日本日立。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10、葡萄糖20、蛋白胨20，瓊脂15～20，115 ℃ 滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10、葡萄糖20、蛋白胨20，115 ℃ 滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖46.67 g/L、木糖23.33 g/L、酵母提取物0.75 g/L、NH4Cl 0.1 g/L、Na2SO40.1 g/L、MgCl2·6H2O 1 g/L、KH2PO411.8 g/L、K2HPO4·3H2O 3.7 g/L、CaCl2·2H2O 40 mg/L、FeSO4·7H2O 5.5 mg/L、一水合檸檬酸 5.2 mg/L、ZnSO4·7H2O 1 mg/L、MnSO4·H2O 0.76 mg/L、18 mol H2SO41.84 μg/L，115 ℃ 滅菌20 min。

1.2.2 高效菌株篩選方法的建立

1.2.2.1 TTC和淺藍(lán)菌素添加濃度的確定

將OD600 nm=1.0野生酵母ZZ-46菌懸液經(jīng)適當(dāng)梯度稀釋后，取100 μL分別涂布于含有不同質(zhì)量濃度TTC(0、1.67×10-2、4.17×10-2、6.67×10-2和9.17×10-2g/L)的YPD平板上，以及含有不同濃度淺藍(lán)菌素(0、1.87×10-6、2.61×10-6、4.11×10-6mol/L)的YPD平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，根據(jù)菌落生長狀況及顏色確定TTC和淺藍(lán)菌素的最佳添加濃度。

1.2.2.2 平板初篩和高通量篩選

將誘變后的菌液涂布在含有篩選因子的平板上，25 ℃培養(yǎng)2 d，挑取大且紅的單菌落到48孔板中(1.0 mL YPD培養(yǎng)基/孔)，在25 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)，2 d后將100 μL的菌液移到96孔板,利用酶標(biāo)儀檢測OD600 nm表征細(xì)胞濃度。

每個(gè)孔板中再添加5 μL尼羅紅溶液，混勻后避光染色5 min，用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度表征油脂產(chǎn)量。檢測的發(fā)射波長和吸收波長分別為485和595 nm。熒光強(qiáng)度為測出的樣品熒光強(qiáng)度減去沒有加尼羅紅的樣品背景熒光強(qiáng)度。

1.2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

挑取初篩得到的高產(chǎn)突變菌株單菌落接種于YPD種子培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min培養(yǎng)36 h，按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種于50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min發(fā)酵7 d。發(fā)酵液離心收集菌體，測定菌體生物量、發(fā)酵液油脂產(chǎn)量以及菌體油脂含量。

1.2.3 菌株誘變方法

1.2.3.1 菌懸液的制備

保藏的菌株經(jīng)活化后，挑取單菌落于YPD種子培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min培養(yǎng)36 h，取1.0 mL菌液8 000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，在渦旋儀上混勻，經(jīng)過適當(dāng)稀釋，制備成OD600 nm=1.0的菌懸液。

1.2.3.2 ARTP誘變

按上述方法制備ZZ-46菌懸液，取10 μL于無菌金屬載片上，將金屬載片置于ARTP誘變儀操作室載物臺的凹槽內(nèi)，誘變條件：功率100 W，處理距離2 mm，氣體流量10 min/L，處理時(shí)間分別為20、50、80、110、140和170 s。將經(jīng)過ARTP處理過的樣品適當(dāng)稀釋后涂布于YPD平板上25 ℃培養(yǎng)2 d，未經(jīng)ARTP處理的菌液進(jìn)行相同濃度稀釋后涂布于平板，培養(yǎng)條件相同，以此作為對照，按公式(1)計(jì)算致死率:

100

(1)

1.2.3.3 DES誘變

通過ARTP誘變獲得的高產(chǎn)突變菌株在斜面上活化，按照上述方法制備菌懸液2.0 mL，加入2.0 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，再加入0.2 mL 50%硫酸二乙酯-乙醇溶液，25 ℃分別振蕩10、30、50、70、90和110 min。每次處理后，向反應(yīng)混合物中加入1.0 mL 250 g/L硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)物稀釋到適當(dāng)濃度，取100 μL涂布于YPD平板，25 ℃培養(yǎng)2 d，以稀釋倍數(shù)相同且未經(jīng)處理的菌懸液為對照，計(jì)算致死率(公式同上)。

1.2.4 分析方法

生物量的測定和油脂的提取參照文獻(xiàn)[18-19];脂肪酸組成分析參照文獻(xiàn)[19-20];利用液相色譜儀測定葡萄糖和木糖含量參照文獻(xiàn)[21]。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性分析

將誘變菌株在平板培養(yǎng)基上連續(xù)傳代 7 次，再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測菌株的生物量和油脂產(chǎn)量，研究其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC和淺藍(lán)菌素添加濃度的確定

TTC是一種氧化還原劑，溶于水時(shí)無色，當(dāng)接受脫氫酶脫下來的H+時(shí)被還原成紅色物質(zhì)三苯基甲臢(triphenyl formazan,TF)，其顏色越深則表示脂肪酸脫氫酶的活性越強(qiáng)，不飽和脂肪酸的含量就越高[22]。淺藍(lán)菌素是一種抗真菌抗生素，可抑制脂肪酸合酶的活性，從而不可逆地抑制內(nèi)源性脂肪酸的合成，阻礙菌體的正常生長[23]。因此，只有高活性脂肪酸合酶的酵母才能在一定濃度的淺藍(lán)菌素平板上存活而被篩選出來。本實(shí)驗(yàn)將TTC和淺藍(lán)菌素作為抗性篩選因子添加到固體YPD培養(yǎng)基中，采用1.2.2.1小節(jié)中的方法對TTC和淺藍(lán)菌素添加濃度進(jìn)行探究,結(jié)果如圖1所示。

a-TTC;b-淺藍(lán)菌素圖1 不同濃度TTC和淺藍(lán)菌素對ZZ-46的生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TTC and cerulenin on the growth of ZZ-46

隨著TTC添加質(zhì)量濃度升高，菌落直徑越來越小，紅色也越來越淺。根據(jù)菌落顏色深淺以及生長狀況，在保證TTC最佳染色濃度的同時(shí)，盡量減弱TTC對菌落的生長影響，最終確定TTC的添加質(zhì)量濃度為1.67×10-2g/L。淺藍(lán)菌素能抑制酵母ZZ-46生長，且隨著淺藍(lán)菌素濃度升高，菌落直徑越來越小，酵母受到的抑制作用越強(qiáng)烈。當(dāng)添加淺藍(lán)菌素的濃度為4.11×10-6mol/L時(shí)，酵母ZZ-46生長受到明顯抑制，較對照有顯著差異，為了保證篩選效果，最終選取4.11×10-6mol/L作為淺藍(lán)菌素的最佳添加濃度。

2.2 ARTP誘變及突變菌株的選育

誘變強(qiáng)度和時(shí)間都會影響細(xì)胞的致死率，適當(dāng)?shù)闹滤缆什庞欣诰旰Y選。采用1.2.3.2小節(jié)的方法考察野生油脂酵母ZZ-46的誘變時(shí)間和致死率關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。

隨著誘變時(shí)間延長，菌落的數(shù)量越來越少，致死率越來越高。當(dāng)處理時(shí)間的140 s時(shí)，致死率達(dá)到96.1%，處理170 s時(shí)，致死率達(dá)到100%。由于ARTP誘變產(chǎn)生的突變具有隨機(jī)性，致死率和正突變之間的關(guān)系并不明確，這主要取決于誘變方法和菌株自身特性[16]。因此，為了獲得生存能力較強(qiáng)的菌株，本研究選擇致死率超過95%的140 s為最佳誘變時(shí)間。

圖2 野生油脂酵母ZZ-46的ARTP致死率曲線Fig.2 ARTP lethality cur e of wild oil yeast ZZ-46

將經(jīng)過ARTP處理140 s后的酵母稀釋到合適濃度并涂布到含有1.67×10-2g/L TTC和4.107×10-6mol/L淺藍(lán)菌素的YPD平板上。按照1.2.2.2小節(jié)中的方法進(jìn)行平板初篩和高通量篩選，測得各突變菌株的OD600 nm和熒光強(qiáng)度。如圖3所示，表明原始菌株和誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強(qiáng)度(培養(yǎng)48 h，原始菌株為1)。以熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，ZZ-46正突變率為43%，生物量總體相差不大。其中，有6株突變菌(G1、A4、C4、H4、B6和H6)的熒光強(qiáng)度是出發(fā)菌株的1.2倍以上，選擇這6株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩。

圖3 ARTP誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強(qiáng)度Fig.3 Relati e OD600 nm and fluorescence intensity of ARTP mutagenic strains

將誘變菌株G1、A4、C4、H4、B6和H6和野生菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵7 d后收集菌體，檢測生物量、油脂產(chǎn)量。結(jié)果如圖4所示，與野生菌相比，所篩選6株菌的油脂產(chǎn)量和油脂含量均有所提高，除B6、H6外，其他菌株的生物量都有所降低。綜合生物量和油脂產(chǎn)量2個(gè)指標(biāo)，B6較出發(fā)菌呈現(xiàn)出更大的優(yōu)勢，生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到21.75、10.31 g/L，較出發(fā)菌分別提高8.10%、20.0%。

圖4 ARTP誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果Fig.4 Rescreening results of ARTP mutagenic strains

2.3 DES誘變及突變菌株的選育

采用1.2.3.3小節(jié)中的方法考察突變菌株B6的誘變時(shí)間和致死率關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。隨著誘變時(shí)間延長，菌落數(shù)量越來越少，當(dāng)誘變時(shí)間為70 min時(shí)，致死率為77%，誘變時(shí)間延長至90和110 min時(shí)，致死率分別為88.23%和95.23%。選擇70%～80%的致死率作為誘變計(jì)量[24]，故DES誘變時(shí)間選擇70 min。

將DES處理70 min后的B6突變菌按上述方法進(jìn)行平板初篩和高通量篩選，測得各突變株的OD600 nm和熒光強(qiáng)度。B6和誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強(qiáng)度(培養(yǎng)48 h，B6菌株為1)如圖6所示，正突變率不如ARTP誘變顯著，與ARTP誘變相比，沒有突變菌株的熒光強(qiáng)度增加20%。突變菌株L7和N7的熒光強(qiáng)度比出發(fā)菌B6增加10%左右，選擇這2株菌進(jìn)行發(fā)酵搖瓶復(fù)篩。

圖5 突變菌株B6的DES致死率曲線Fig.5 DES lethality cur e of mutant strain B6

圖6 DES誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強(qiáng)度Fig.6 Relati e OD600 nm and fluorescence intensity of DES mutagenic strains

將突變菌株L7、N7和出發(fā)菌株B6進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵7 d后收集菌體，檢測生物量、油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖7所示。

圖7 DES誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果Fig.7 Rescreening results of DES mutagenic strains

經(jīng)過搖瓶復(fù)篩之后，突變菌L7呈現(xiàn)出最大的優(yōu)勢，其生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別達(dá)到22.66 g/L、11.44 g/L和50.49%，較突變菌B6分別提高4.18%、10.96%和3.09%，較野生型菌株ZZ-46分別提高12.62%、33.18%和7.8%。為了研究突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)對菌株L7進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第1代到第7代的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別維持在22.6 g/L、11.5 g/L和50.7%左右，表明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 油脂脂肪酸組成

對野生菌株ZZ-46和突變菌株B6、L7所產(chǎn)油脂進(jìn)行脂肪酸成分分析，結(jié)果如表1所示。誘變前后脂肪酸組成相同，主要是棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，其中油酸含量最多、棕櫚酸次之、硬脂酸和亞油酸含量接近，這4種脂肪酸占總脂肪酸的95%以上，與植物油的脂肪酸組成類似[25]。其中，L7與ZZ-46相比，不飽和脂肪酸亞油酸含量上升2.11%，這可能是因?yàn)橥蛔兙甑闹舅崦摎涿富钚愿?，其余脂肪酸含量并沒有發(fā)生太大變化，可以作為生產(chǎn)生物柴油的原料。

2.5 野生菌株ZZ-46和突變菌株L7利用混合糖的發(fā)酵曲線

木質(zhì)纖維素完全水解后得到的葡萄糖和木糖能達(dá)到總糖的90%以上，且兩者的質(zhì)量比約為2∶1[18]，因此選擇葡萄糖∶木糖=2∶1(質(zhì)量比)的初始碳源模擬纖維素水解液，總糖質(zhì)量濃度保持70 g/L?？疾煲吧闦Z-46和突變菌株L7生長和積累油脂的情況，結(jié)果如圖8所示。

a-野生菌體ZZ-46; b-突變菌體L7圖8 野生菌株ZZ-46和突變菌株L7的發(fā)酵曲線圖Fig.8 Fermentation cur e of wild strain ZZ-46 and mutant strain L7

表1 野生菌株和突變菌株的脂肪酸組成及含量Table 1 Fatty acid composition and content of wild and mutant strains

由圖8可知，ZZ-46和L7的油脂積累和菌體生長均是生長偶聯(lián)型，且L7的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量明顯高于ZZ-46。在培養(yǎng)第7天時(shí)，兩者油脂含量均達(dá)到最大，分別是42.67%和50.49%，繼續(xù)培養(yǎng)后，雖然生物量有所增加，但是油脂產(chǎn)量和油脂含量均在下降，表明細(xì)胞在消耗完培養(yǎng)基中的碳源后，又開始消耗胞內(nèi)油脂作為能量以維持細(xì)胞增殖。從葡萄糖和木糖的利用情況來看，ZZ-46和L7均能同時(shí)利用葡萄糖和木糖，葡萄糖的存在并不會抑制細(xì)胞對木糖的利用，克服了大多數(shù)微生物存在的葡萄糖效應(yīng)，這可能是因?yàn)樵摼甑?種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有相似的效率，或者存在對這2種糖具有相同親和力的獨(dú)特糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在此酵母中運(yùn)行[25]。此外，L7比ZZ-46提前1 d消耗完混合糖，表明L7的糖耗速率和糖轉(zhuǎn)化能力都顯著高于野生菌株，可能是因?yàn)長7的脂肪酸合酶具有更高的活性。這些特性對利用纖維素水解液發(fā)酵、降低微生物油脂生產(chǎn)成本具有重要意義不少研究者探討產(chǎn)油酵母利用混合糖積累油脂的能力。宋兆齊等[6]篩選獲得1株油脂酵母JM-D，在葡萄糖∶木糖=3∶1質(zhì)量濃度比混合糖條件下菌體油脂含量達(dá)到23.38%，油脂產(chǎn)量達(dá)到2.7 g/L；孔祥莉等[18]研究斯達(dá)氏油脂酵母L.starkeyi2#在葡萄糖∶木糖=23∶12質(zhì)量濃度比混合糖條件下發(fā)酵積累油脂，生物量和油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到19.0 g/L和52.6%；HU等[25]利用T.cutaneumAS 2.571在葡萄糖∶木糖=47∶23質(zhì)量濃度比混合糖條件下發(fā)酵積累油脂，生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別達(dá)到23.2 g/L、11.2 g/L和48.4%；YU等[26]利用T.dermatis32903在葡萄糖∶木糖=3∶1質(zhì)量濃度比混合糖條件下發(fā)酵積累油脂，OD600 nm達(dá)到71.13，油脂產(chǎn)量達(dá)到11.48 g/L。

相比上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在相同比例的混合糖中，L7具有較為突出的油脂積累能力，此外，L.starkeyi2#在發(fā)酵前期以利于葡萄糖為主，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于16 g/L時(shí)，木糖的消耗速率明顯加快，高濃度葡萄糖阻礙了菌株對木糖的利用，并不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的同步利用葡萄糖和木糖。T.dermatis32903雖然可以在初始濃度較高的糖中進(jìn)行發(fā)酵，但是木糖的利用率僅為85.9%，且混合糖中木糖的比例不高，而L7可以完全利用發(fā)酵液中的木糖，不會造成木糖浪費(fèi)，也不需要改變水解液中葡萄糖和木糖的比例。

3 結(jié)論

本文采用ARTP和DES復(fù)合誘變方法獲得1株高產(chǎn)油脂酵母L7，其生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量較野生型菌株ZZ-46分別提高了12.62%、33.18%和7.8%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，脂肪酸組成與植物油相似。該突變菌株L7具有同時(shí)消耗葡萄糖和木糖積累油脂的能力，具有利用木質(zhì)纖維素水解液的潛力，為規(guī)模化生產(chǎn)微生物油脂提供可能。