余達勇，陳碧秀，鐘永軍，粱秀燕，何昕蔚，夏海洋，鮑佳偉

( 1.臺州學(xué)院 生物制藥研究所，浙江 臺州 318000； 2.臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000；3.浙江宏野海產(chǎn)品有限公司，浙江 臨海 317000 )

急性肝胰腺壞死病是目前威脅凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要細菌性病害。早期該病主要發(fā)生于對蝦的育苗期，因而也被稱為早期死亡綜合征?；技毙愿我认賶乃啦〉膶ξr一般具有體色發(fā)白，蝦殼變軟，攝食明顯減少，肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅，空腸空胃等特征[1]。自2009年發(fā)現(xiàn)以來，已給中國[2]、泰國[3]、墨西哥[4]和菲律賓[5]等國的凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。研究表明，凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病致病菌含有致死性毒因子PirVP(包含毒性蛋白PirA和PirB)[6]，其作用于肝胰腺而使上皮細胞脫落，進而造成肝胰腺功能喪失。已有的報道顯示，致死性毒因子PirVP主要發(fā)現(xiàn)于弧菌中[6]，包括副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[7-9]、哈維氏弧菌(V.harveyi)[10]、坎氏弧菌(V.campbellii)[2]，在其他少見的弧菌中也有發(fā)現(xiàn)[11-12]。毒性基因pirA和pirB多見于質(zhì)粒上，常見的為69 kb大小質(zhì)粒pVA1[6]，也見有183 kb大小質(zhì)粒[13]。

PCR檢測是常用的對蝦急性肝胰腺壞死病致病菌快速檢測方法。Flegel等[14]首次報道了檢測急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌的AP1引物和AP2引物。Sirikharin等[15]針對pirA基因開發(fā)了AP3檢測引物，靈敏度和準(zhǔn)確度較之前的引物有明顯提高。Dangtip等[16]利用巢式PCR的方法開發(fā)了AP4檢測引物，靈敏度較AP3引物提高了約100倍。在致病菌株的分類上，賈丹等[17]發(fā)現(xiàn)分子伴侶蛋白groEL比16S rRNA基因更有優(yōu)勢。孫明玉等[9]利用副溶血弧菌的7個管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA對12株急性肝胰腺壞死病致病菌進行多位點序列分型(MLST)。Machado等[18-19]開發(fā)了基于fur基因的弧菌科屬種分類鑒定方法，克服了16S rRNA基因序列在弧菌科屬種分類鑒定中區(qū)分度低的問題。

臺州是浙江省海水養(yǎng)殖凡納濱對蝦的重要產(chǎn)區(qū)。臺州本地的海水養(yǎng)殖凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)也正面臨著急性肝胰腺壞死病的威脅，但至今未見臺州急性肝胰腺壞死病致病菌株及其藥敏特性的詳細研究報道?；诖?，筆者自臺州本地凡納濱對蝦養(yǎng)殖場分離對蝦急性肝胰腺壞死病致病菌株，并對致病菌株進行分子鑒定、藥敏性研究和漁用消毒劑的殺菌試驗，以期為臺州凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病的防治提供技術(shù)支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與主要試劑

弧菌檢測培養(yǎng)基(硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；Taq DNA聚合酶[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；Mueller-Hinton瓊脂(杭州百思生物技術(shù)有限公司)；柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；海水晶(臺州市鹽業(yè)有限公司)；新潔爾滅、過氧乙酸(山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司)；二氧化氯(仙桃市湖濱漁躍水產(chǎn)藥業(yè)有限公司)。其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司或生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 弧菌分離與培養(yǎng)

于2018年在對蝦養(yǎng)殖場采集發(fā)病凡納濱對蝦，用接種環(huán)蘸取病蝦的肝胰腺部位，劃線于弧菌檢測瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h。次日，自弧菌檢測瓊脂平板上隨機挑取綠色單菌落10個，劃線于3%氯化鈉的LB平板上，進行單菌落純化，反復(fù)劃線純化單菌落4次，將純化的10個單菌落于-80 ℃甘油管凍存。

1.3 PCR檢測

用柱式細菌基因組抽提試劑盒抽提細菌基因組，以基因組DNA為模板，分別用表1中的引物進行PCR，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，再用凝膠成像系統(tǒng)檢測，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used in the experiment

1.4 對蝦攻毒試驗

病原菌株的毒性鑒定參考文獻[29]的浸泡攻毒方法，略有調(diào)整：由附近養(yǎng)殖場采集健康的凡納濱對蝦(約1 g)，在人工海水(每千克海水晶兌33 L蒸餾水)中適應(yīng)4～5 d。每組15尾對蝦，設(shè)置3個平行組；試驗組浸泡于病菌600 mm光密度值(OD600)=1的人工海水中，對照組浸泡于無病菌的人工海水中，浸泡15 min。將浸泡后的對蝦取出，試驗組轉(zhuǎn)入病原菌OD600=0.01的3 L海水中，對照組轉(zhuǎn)入3 L的無病原菌人工海水中。試驗持續(xù)7 d，水溫控制在25 ℃，每日正常投喂、吸污、換水，記錄對蝦死亡情況，死亡對蝦及時撈出，最后統(tǒng)計對蝦累積死亡率。

1.5 藥敏試驗

用紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗：自新鮮胰蛋白胨大豆肉湯平板上挑取單菌落，接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中， 37 ℃，200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜；以1∶100(V/V)的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h后，待菌液的OD600達到2時，取100 μL菌液，均勻涂布于3%氯化鈉的Mueller-Hinton瓊脂平板上，超凈工作臺靜置15 min，貼上藥敏紙片，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后測量并記錄抑菌圈直徑，每種抗生素做3個平行。用大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922作為質(zhì)控菌(特別說明的除外)，受試菌株對21種抗生素的藥敏性參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會的方法和標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 漁用消毒劑殺菌試驗

將30 ℃、200 r/min恒溫搖床振蕩過夜培養(yǎng)的菌液加入到100 mL人工海水中，使人工海水中菌株HY3菌液的終密度約為1×106cfu/mL，每批次試驗采用同一批新鮮HY3菌液進行；再分別加入消毒劑稀釋液，30 ℃培養(yǎng)箱中靜置孵育2 h后，適當(dāng)稀釋并涂布營養(yǎng)平板；30 ℃培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)，取平均值，計算消毒劑的殺菌效果。每種消毒劑設(shè)1/5A、A和10A這3個劑量(A為漁業(yè)常規(guī)使用劑量)，每個梯度設(shè)3個平行組。根據(jù)產(chǎn)品有效含量進行換算，次氯酸鈣、二氧化氯、高錳酸鉀、新潔爾滅和過氧乙酸的質(zhì)量濃度值A(chǔ)分別為1.0、0.3、10.0、1.0、1.0 mg/L。

2 結(jié) 果

2.1 急性肝胰腺壞死病致病菌分離及分子鑒定

自臺州凡納濱對蝦養(yǎng)殖場分離到10株在弧菌檢測瓊脂平板上呈綠色單菌落，分別抽取基因組后利用AP3-F/AP3-R檢測致病基因，其中6株有陽性條帶，16S rRNA測序顯示，這6株高度相似，均可能為急性肝胰腺壞死病致病菌，選擇其中編號為HY3菌株進行后續(xù)試驗。HY3菌株在弧菌檢測瓊脂平板上呈圓形、表面光滑的綠色菌落。用引物VG-F/VG-R進行PCR，擴增出約700 bp的特異性條帶(圖1)并送測序，測序結(jié)果表明，菌株HY3為弧菌屬細菌；分別用引物ToxR-F/ToxR-R、Tlh-F/Tlh-R和AP3-F/AP3-R進行PCR，依次擴增出約350、450、340 bp特異性條帶(圖1)，菌株HY3含有toxR、tlh基因和pirA基因；再用引物Tdh-L/Tdh-R和Trh-L/Trh-R進行PCR，未擴增出預(yù)期條帶(圖1)。為進一步分析菌株HY3的pirA、pirB基因序列特征，用引物PirAB-2020F/PirAB-2020R擴增pirA、pirB基因及其部分上下游序列，測序結(jié)果顯示，菌株HY3的pirA和pirB基因序列與相關(guān)報道的結(jié)果一致(GenBank登陸號MH718270)。

圖1 菌株HY3 PCR分析Fig.1 PCR analysis of strain HY3M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1～6分別為引物VG-F/R、ToxR-F/R、Trh-F/R、Tlh-F/R、Tdh-F/R、AP3-F/R的PCR擴增條帶.M.DNA marker; Lanes 1—6.PCR products by primers VG-F/R, ToxR-F/R, Trh-F/R, Tlh-F/R, Tdh-F/R and AP3-F/R, respectively.

為確定菌株HY3的分類地位，用引物27F/1492R對菌株HY3的16S rRNA基因序列進行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，菌株HY3與副溶血弧菌聚為一支(圖2)。進一步，用引物fur_V_fw/fur_TS_rv對菌株HY3的fur基因進行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，菌株HY3與副溶血弧菌聚為一支(圖3)。結(jié)合菌株HY3在弧菌檢測瓊脂平板上的菌落特征，最后鑒定菌株HY3為副溶血弧菌。

2.2 回接感染試驗

采用浸泡攻毒方法對副溶血弧菌HY3的致病性進行試驗。典型的結(jié)果見圖4a，與未接種的對照組相比，接種副溶血弧菌HY3的凡納濱對蝦表現(xiàn)出空腸、空胃，肝胰腺發(fā)黃或發(fā)白癥狀。統(tǒng)計累積死亡率顯示，浸泡攻毒處理組的對蝦累積死亡率隨著試驗時間的延長而增多，感染后第3 d對蝦累積死亡率超過50%，在第7 d時對蝦的累積死亡率接近100%，而對照組在試驗過程中未發(fā)生死亡現(xiàn)象(圖4b)。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的菌株HY3與相近典型菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain HY3 and other related typical strains based on 16S rRNA sequences系統(tǒng)進化樹采用鄰接法構(gòu)建；分支數(shù)表示1000次Bootstrap重抽樣分析的支持百分比；圖例0.001為遺傳距離.The phylogenetic tree is generated using the neighbor-joining method; the number of branches indicates the percentage of support for 1 000 bootstrap resampling analysis; the legend 0.001 is the genetic distance.

圖3 基于fur基因序列構(gòu)建的菌株HY3與相近菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HY3 and other related strains based on the fur gene sequences系統(tǒng)進化樹采用鄰接法構(gòu)建；分支數(shù)表示1000次Bootstrap重抽樣分析的支持百分比；圖例0.02為遺傳距離.The phylogenetic tree is generated using the neighbor-joining method; the number of branches indicates the percentage of support for 1000 bootstrap resampling analysis; the legend 0.02 is the genetic distance.

圖4 凡納濱對蝦感染副溶血弧菌HY3的死亡率Fig.4 Mortalities of Pacific white shrimp L. vannamei infected with V. parahaemolyticus HY3a.感染副溶血弧菌HY3后的凡納濱對蝦特征； b.感染副溶血弧菌HY3后的累積死亡率.a.characteristics of Pacific white shrimp L. vannamei infected with V. parahaemolyticus HY3; b.cumulative mortality of Pacific white shrimp L. vannamei infected with V. parahaemolyticus HY3.

2.3 藥敏分析

用藥敏紙片法對21種抗生素進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，副溶血弧菌HY3對不同抗生素的敏感性不同。其中，副溶血弧菌HY3對頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢替坦、萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素、氯霉素、四環(huán)素、呋喃妥因、氨芐西林/舒巴坦表現(xiàn)為敏感；對卡那霉素、丁胺卡那表現(xiàn)為中度敏感；而對鏈霉素、氨芐西林表現(xiàn)為耐藥(表2)。

表2 副溶血弧菌HY3的藥敏分析Tab.2 Drug susceptibility of V. parahaemolyticus HY3

2.4 抗生素抗性基因檢測

為探究副溶血弧菌HY3對鏈霉素和氨芐西林的耐藥機制，用抗生素抗性基因檢測引物TEM-F/TEM-R、StrA-F/StrA-R和StrB-F/StrB-R分別對副溶血弧菌HY3基因組進行擴增(圖5)。引物TEM-F/TEM-R、StrA-F/StrA-R和StrB-F/StrB-R分別擴增出大小約為800、500、500 bp特異條帶，與預(yù)期的條帶大小一致。將PCR擴增條帶進行測序，結(jié)果進一步證實，副溶血弧菌HY3含有抗生素抗性基因blaTEM、strA-strB。

圖5 抗生素抗性基因PCR凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.5 Electrophoresis analysis of PCR product of antibiotic resistance genes M.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1～3分別為引物TEM-F/R、StrA-F/R、StrB-F/R的PCR擴增條帶.M.DNA marker; lanes 1—3.PCR products by primers TEM-F/R, StrA-F/R and StrB-F/R, respectively.

2.5 漁用消毒劑殺菌試驗

對次氯酸鈣、新潔爾滅、過氧乙酸、二氧化氯和高錳酸鉀這5種常用的漁用消毒劑進行殺菌試驗。結(jié)果顯示，消毒劑的種類和劑量對副溶血弧菌HY3的殺菌效果影響很大(表3)。在常用劑量下的殺菌效果為高錳酸鉀>過氧乙酸>次氯酸鈣>新潔爾滅>二氧化氯，其中，質(zhì)量濃度10 mg/L高錳酸鉀溶液處理2 h的殺菌率達到99.99%。

表3 5種消毒劑對副溶血弧菌HY3的殺菌試驗Tab.3 Efficacy of five disinfectants onV. parahaemolyticus HY3 killing

3 討 論

3.1 對蝦急性肝胰腺壞死病菌的致病基因

自臺州養(yǎng)殖凡納濱對蝦養(yǎng)殖場中分離到的急性肝胰腺壞死病致病菌被鑒定為副溶血弧菌，這與報道的副溶血弧菌是常見的急性肝胰腺壞死病致病菌相符。由于副溶血弧菌有攜帶人類臨床致病基因tdh(耐熱性溶血毒素)和trh(耐熱性溶血毒素相關(guān)的溶血毒素)的風(fēng)險，因而對副溶血弧菌HY3進行了tdh和trh的PCR檢測，結(jié)果表明，副溶血弧菌HY3不含人類臨床致病基因tdh和trh。類似的，Joshi等[3]報道了從泰國分離的急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌菌株和Soto-Rodriguez等[7]報道了從墨西哥分離的急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌菌株也均不攜帶tdh和trh基因。因此可以認為，急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌導(dǎo)致人蝦共患疾病的可能性很小[1]。

3.2 對蝦急性肝胰腺壞死病菌的耐藥性

急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌的耐藥性問題已經(jīng)引起了人們的重視。賈丹等[17]研究發(fā)現(xiàn)，急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌菌株20160303005-1對慶大霉素、環(huán)丙沙星和頭孢他啶等16種藥物敏感，對阿莫西林、替卡西林、頭孢呋辛、頭孢噻吩和復(fù)方新諾明表現(xiàn)為耐藥。Lai等[30]對7株急性肝胰腺壞死病相關(guān)副溶血弧菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，這些副溶血弧菌普遍對氨芐西林、鏈霉素、磺胺甲惡唑、磷霉素和二環(huán)霉素具有抗藥性。Dong等[31]對急性肝胰腺壞死病致病菌株Vp2S01進行了藥敏試驗，結(jié)果顯示，菌株Vp2S01只對氟苯尼考敏感，而對氨芐西林、鏈霉素和四環(huán)素等14種抗生素耐藥。Han等[32]研究發(fā)現(xiàn)，急性肝胰腺壞死病致病菌性副溶血弧菌對較高質(zhì)量濃度(≥5 μg/mL)的四環(huán)素耐藥，并檢測到了tetB抗性基因。在本試驗中，副溶血弧菌HY3對氨芐西林和鏈霉素耐藥，并檢測到了相應(yīng)的抗性基因blaTEM和strA-strB。由此可見，不同地區(qū)分離的急性肝胰腺壞死病致病菌株的耐藥性不盡相同，實際防治過程中需要針對性地用藥，才能起到良好的防治效果?？紤]到抗生素的大量使用或濫用與耐藥性間的相關(guān)性，在實際的對蝦養(yǎng)殖過程中，應(yīng)盡量減少抗生素藥劑的使用。甄曉然等[33]自海洋灘涂沉積物中分離到1株普羅威登斯菌(Providenciasp.)，其對急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌具有高效拮抗作用，為對蝦急性肝胰腺壞死病的防控提供了新的思路。

3.3 漁用消毒劑的防治應(yīng)用

對養(yǎng)殖海水進行定期消毒是常見的防治手段，二氧化氯、漂白粉、過氧乙酸等是常見的漁用消毒劑。張繼平等[34]認為，穩(wěn)定性二氧化氯可應(yīng)用于凡納濱對蝦的疾病防治。劉志軒等[35]研究了4種消毒劑對急性肝胰腺壞死病致病性弧菌的殺滅作用，發(fā)現(xiàn)殺菌能力依次為聚六亞甲基胍>雙氧水>二氧化氯>聚維酮碘。本試驗結(jié)果顯示，高錳酸鉀和過氧乙酸對急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌HY3的殺菌效果較好。由此可見，正確選擇消毒劑對防控急性肝胰腺壞死病致病菌具有重要的現(xiàn)實意義和指導(dǎo)作用。

4 結(jié) 論

臺州凡納濱對蝦養(yǎng)殖場中引起對蝦急性肝胰腺壞死的致病菌主要是副溶血弧菌，檢測顯示，分離株對氨芐西林、鏈霉素有抗性。并且，檢測顯示分離株不攜帶人類臨床致病基因tdh(耐熱性溶血毒素)和trh(耐熱性溶血毒素相關(guān)的溶血毒素)，對人的風(fēng)險低。此外，臺州凡納濱對蝦養(yǎng)殖場防治對蝦急性肝胰腺壞死病需要避免使用氨芐西林、鏈霉素，可以采用高錳酸鉀作為養(yǎng)殖場消毒劑防治該病。