胡玉婷，段國(guó)慶，凌 俊，周華興，潘庭雙，江 河

( 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031 )

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，屬鲇形目，鲿科，廣泛分布于除西部高原和新疆外的中國(guó)各大水系，特別是長(zhǎng)江中下游的湖泊、溪流等水域中[1-2]。黃顙魚是鲿科魚類中最常見(jiàn)的物種，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類和主要養(yǎng)殖對(duì)象。近年來(lái)，由于黃顙魚、雜交黃顙魚(P.fulvidraco♀×P.vachelli♂)的人工養(yǎng)殖日益發(fā)展，以及各地黃顙魚的相互交易，導(dǎo)致黃顙魚種質(zhì)混雜難以避免；考慮到棲息地破壞、水質(zhì)污染、過(guò)度捕撈等因素，野生黃顙魚資源日益減少。安徽所屬長(zhǎng)江、淮河水系是黃顙魚的重要棲息地之一，目前未有對(duì)其群體遺傳狀況研究，而黃顙魚資源的保護(hù)及進(jìn)一步開發(fā)必須建立在了解其種質(zhì)遺傳現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上。因此，開展黃顙魚群體遺傳結(jié)構(gòu)研究很有必要。

魚類線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)基因，除具有動(dòng)物線粒體的分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化中性、檢測(cè)方便、母系遺傳、無(wú)重組等特征外，還兼有進(jìn)化速度適中，易為保守引物擴(kuò)增等特性，廣泛用于魚類的群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究[3-8]，在黃顙魚種群遺傳變異和系統(tǒng)演化關(guān)系方面也已進(jìn)行了一些研究[9-11]。如庫(kù)喜英等[9-10]分析了中國(guó)6大水系(長(zhǎng)江、珠江、遼河、閩江、富春江和韓江)、長(zhǎng)江中下游5個(gè)湖泊(鄱陽(yáng)湖、巢湖、滆湖、洪澤湖、太湖)的黃顙魚群體遺傳變異，結(jié)果表明，黃顙魚群體遺傳多樣性表現(xiàn)中等，但群體間遺傳分化極小、缺乏明顯的地理結(jié)構(gòu)；而張鶴千等[11]研究了珠江水系5個(gè)江段黃顙魚的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，不同江段間存在顯著的遺傳分化。但上述研究均不涉及淮河水系以及安徽長(zhǎng)江水系，筆者采用線粒體Cyt b部分序列為分子標(biāo)記，探討安徽長(zhǎng)江、淮河兩大水系野生黃顙魚群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為黃顙魚的育種和資源保護(hù)提供理論基礎(chǔ)，并對(duì)比較不同水系間黃顙魚的遺傳變異，維護(hù)黃顙魚種質(zhì)資源的生物多樣性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

黃顙魚樣品于2018—2019年采集于安徽長(zhǎng)江和淮河水系8個(gè)地點(diǎn)(表1、圖1)。取新鮮樣品魚肌肉于無(wú)水乙醇中固定，于冰箱4 ℃密封保存。

表1 黃顙魚樣本采集信息Tab.1 Information on samples of yellow catfish P. fulvidraco

圖1 黃顙魚采樣示意Fig.1 Sampling localities of yellow catfish P. fulvidraco in the study

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用動(dòng)物基因組提取試劑盒提取黃顙魚基因組DNA。PCR擴(kuò)增與測(cè)序引物均為通用引物L(fēng)14724和H15915[12]，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[10]中的Cyt b序列的擴(kuò)增方法。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的目標(biāo)PCR產(chǎn)物委托生物公司雙向測(cè)序。

1.3 序列比對(duì)分析

采用軟件Seaview[13]和Bioedit[14]拼接校正所得序列，并通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的Blast比對(duì)分析，驗(yàn)證這些序列均為目的基因。

多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性與核苷酸多樣性由軟件DNAsp 5.0[15]計(jì)算。MEGA 4.0[16]計(jì)算序列堿基組成、變異率、轉(zhuǎn)換與顛換比值、群體內(nèi)及群體間遺傳距離；基于群體間遺傳距離構(gòu)建群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用1000次自展分析進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)?；贜etwork 4.600[17]中中間連接法繪制黃顙魚單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖。

由Arlequin 3.5[18]計(jì)算群體分化指數(shù)(FST)和進(jìn)行分子變異分析，分別用于評(píng)估群體間遺傳差異和檢驗(yàn)群體間遺傳變異來(lái)源，都通過(guò)1000次重抽樣來(lái)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。設(shè)定兩種分子變異分析檢驗(yàn)黃顙魚的群體遺傳結(jié)構(gòu)：將所有群體劃分為一個(gè)組群和將所有群體根據(jù)水系劃分為兩個(gè)組群以驗(yàn)證是否存在顯著遺傳分化。群體間基因流Nm=(1/FST-1)/2[19]。

2 結(jié) 果

2.1 序列多態(tài)性

212尾黃顙魚Cyt b同源序列長(zhǎng)度均為1122 bp(Cyt b基因第10至1131位)，堿基T、C、A、G的含量分別為26.3%、32.1%、27.7%和13.9%，存在明顯的A/T堿基偏向(A/T含量54.0%大于G/C含量46.0%)和較強(qiáng)的反G偏倚，G含量明顯低于其他堿基，尤其在密碼子第二(13.4%)和第三位(2.5%)，而第一位的堿基組成相近(T：25.1%，C：26.8%，A：22.5%，G：25.7%)。這些都與脊椎動(dòng)物線粒體DNA的特征一致[20-22]。

所有序列共有變異位點(diǎn)48個(gè)(多態(tài)率4.28%)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)20個(gè)、單突變位點(diǎn)28個(gè)。變異主要發(fā)生于密碼子第3位(32個(gè))，然后為第1位(14個(gè))、第2位(2個(gè))；變異多為同義突變的現(xiàn)象符合魚類線粒體中氨基酸變化速率較慢的特征[20]。序列變異中轉(zhuǎn)換明顯大于顛換(比率7.795)、轉(zhuǎn)換偏向的核苷酸替換特征符合線粒體的一般規(guī)律[23]。

2.2 單倍型分析

212條Cyt b序列片段共檢出49種單倍型，單倍型間的最大變異率僅0.89%，單倍型在各地理群體間的分布見(jiàn)表2。多數(shù)單倍型(32個(gè))為獨(dú)有單倍型，僅包含1個(gè)樣品，共有單倍型17個(gè)，但包含絕大多數(shù)樣品(84.9%)。單倍型間簡(jiǎn)約進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果見(jiàn)圖2。黃顙魚單倍型在不同地理群體間并非隨機(jī)分布的，具有一定的地理遺傳結(jié)構(gòu)。

表2 黃顙魚單倍型在各群體的分布Tab.2 Distributions of haplotype in 8 populations of yellow catfish P. fulvidraco

(續(xù)表2)

圖2 黃顙魚49種單倍型的簡(jiǎn)約進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Statistical parsimony network of 49 haplotypes of yellow catfish P. fulvidraco圓大小與單倍型頻率大小相一致，單倍型間斜體數(shù)字為堿基置換數(shù)，無(wú)斜體數(shù)字則表示堿基置換數(shù)為1，三角形為丟失的單倍型(節(jié)點(diǎn)).Circle sizes are proportional to the frequencies of the haplotype; the italic numbers on the line indicate the number of substitutions between two haplotypes, and the italic number without numbers on the line connecting haplotypes indicates single substitution between two haplotypes; the triangle represents the missing haplotype (node).

2.3 群體遺傳多樣性分析

黃顙魚8個(gè)地理群體的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表3。單倍型多樣性較高(0.930)，除石臺(tái)外(0.554)，其余群體為0.816～0.949；尤其涇縣群體最高(0.949)。而所有群體核苷酸多樣性均偏低(0.00105～0.00221)，其中涇縣群體最高、石臺(tái)群體最低，與單倍型多樣性一致。

2.4 群體遺傳距離和分化

群體遺傳距離結(jié)果(表4)顯示，群體間最大遺傳距離是石臺(tái)與瓦埠湖群體間(0.00382)，最小遺傳距離為望江與龍窩湖群體間(0.001778)。群體內(nèi)遺傳距離為0.00105～0.00222；大于部分群體間遺傳距離，如涇縣群體內(nèi)遺傳距離(0.00222)大于其與3個(gè)群體(望江、龍窩湖、無(wú)為)間的遺傳距離，但小于其與其他4個(gè)群體間的遺傳距離。由于群體內(nèi)的遺傳距離反映了該群體的遺傳多樣性，而不同群體間的遺傳距離反映了其遺傳組成的分化程度。這顯示部分群體內(nèi)存在較高的遺傳多樣性，但這種遺傳多樣性在其他一些群體中由于建群個(gè)體遺傳多樣性較低或遺傳漂變等原因尚未積累太大的區(qū)別。這種現(xiàn)象反應(yīng)了不同群體間復(fù)雜的遺傳進(jìn)化史，也顯示了不同群體間親緣關(guān)系的差異，體現(xiàn)了該區(qū)域總體遺傳分化、部分群體遺傳相似的復(fù)雜地理結(jié)構(gòu)。群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)顯示，8個(gè)地理群體可分為兩大進(jìn)化枝，長(zhǎng)江群體、淮河水系群體各聚為一枝。

表3 黃顙魚群體遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Parameters of genetic diversity in 8 populations of yellow catfish P. fulvidraco

表4 黃顙魚群體內(nèi)(對(duì)角線)和群體間遺傳距離(對(duì)角線下)Tab.4 Pairwise genetic distances among population (below diagonal) and genetic distance within population (diagonal)of yellow catfish P. fulvidraco

圖3 基于線粒體Cyt b序列片段的黃顙魚群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 8 populations of yellow catfish P. fulvidraco based on Cyt b gene fragments

黃顙魚群體間的遺傳分化和基因流分析結(jié)果見(jiàn)表5。群體分化指數(shù)為0.0012～0.5975、基因流為0.337～416.167，總的群體分化指數(shù)和基因流分別為0.2590、1.4305，這表明黃顙魚地理群體間有明顯遺傳分化。

分子變異分析結(jié)果(表6)顯示，第一種分析中地理群體內(nèi)的遺傳變異占比74.1%，群體間變異為25.9%(P<0.001)，顯示黃顙魚地理群體間已產(chǎn)生一定程度的遺傳分化；第二種分析中來(lái)自不同水系即長(zhǎng)江群體與淮河群體之間的遺傳變異為23.58%，來(lái)自同一水系內(nèi)不同地理群體間的遺傳變異僅為10.29%，而來(lái)自地理群體內(nèi)的遺傳變異為66.13%，顯示不同水系的黃顙魚地理群體間具有較高程度的地理差異，存在明顯的地理結(jié)構(gòu)。綜合研究結(jié)果表明，安徽黃顙魚不同地理群體間的遺傳分化主要是由水系間的群體遺傳差異產(chǎn)生的。

表5 基于Cyt b序列的黃顙魚種群成對(duì)群體分化指數(shù)(對(duì)角線下)和基因流(對(duì)角線上)Tab.5 F-Statistics (below diagonal) and gene flow (Nm) (above diagonal) from haplotype frequencies of yellow catfishP. fulvidraco based on Cyt b sequences

表6 基于線粒體Cyt b序列的黃顙魚所有樣品的分子變異分析Tab.6 AMOVA of all samples of yellow catfish P. fulvidraco based on Cyt b gene

3 討 論

3.1 黃顙魚群體遺傳多樣性

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的重要參數(shù)，其數(shù)值大小表示生物適應(yīng)環(huán)境變化能力的強(qiáng)弱。研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)江、淮河水系安徽區(qū)段黃顙魚群體單倍型多樣性(平均0.930，0.554～0.949)較高而核苷酸多樣性(平均0.00236，0.00105～0.00221)較低，其遺傳多樣性處于中等水平。這低于長(zhǎng)江中下游5個(gè)湖泊(巢湖、滆湖、洪澤湖、鄱陽(yáng)湖和太湖)黃顙魚的單倍型多樣性指數(shù)(0.945)和核苷酸多樣性指數(shù)(0.00419)[10]；高于珠江流域黃顙魚的單倍型多樣性(0.849)而顯著低于其核苷酸多樣性(0.04817)[11]，而與庫(kù)喜英等[9]分析的中國(guó)6個(gè)水系黃顙魚的遺傳多樣性結(jié)果(單倍型多樣性0.857，核苷酸多樣性0.0023)相比，本研究單倍型多樣性指數(shù)略高而核苷酸多樣性指數(shù)相近。上述研究結(jié)果均是基于Cyt b序列分析，一致顯示我國(guó)野生黃顙魚群體單倍型多樣性尚處于較高水平，但不同地區(qū)核苷酸多樣性水平相差較大。

同屬魚類相比較，丁言偉[24]通過(guò)線粒體ND4基因探討黃顙魚屬魚類的種群遺傳結(jié)構(gòu)，瓦氏黃顙魚(P.vachelli)的種群遺傳多樣性最高，光澤黃顙魚(P.nitidus)和長(zhǎng)須黃顙魚(P.eupogon)的種群遺傳多樣性次之，黃顙魚的種群遺傳多樣性最小；而且這種遺傳多樣性差異主要體現(xiàn)在核苷酸多樣性水平上。與區(qū)域內(nèi)其他魚類相比較，遠(yuǎn)低于安徽長(zhǎng)江和淮河水系黃鱔(Monopterusalbus)的平均核苷酸多樣性(0.01904、0.01882)[25-26]、也低于淮河野生鲇魚(Silurusasotus)和淮河源區(qū)(Hemiculterleucisculus)的核苷酸多樣性(0.0038、0.0046)[27-28]；與長(zhǎng)江水系大眼鱖(Sinipercakneri)的核苷酸多樣性0.00237相近[29]，而與上述魚類在單倍型多樣度上差異不大。上述研究表明，黃顙魚核苷酸多樣性低是一種普遍現(xiàn)象，而本研究的黃顙魚核苷酸多樣性幾乎最低。由于單倍型多樣性是基于核苷酸多樣性在群體中的分布，而核苷酸多樣性比單倍型多樣性更易受到遺傳漂變等的影響、且一旦降低更難恢復(fù)。近年來(lái)，黃顙魚及雜交黃顙魚的人工養(yǎng)殖日益發(fā)展，以及各地黃顙魚的相互交易，導(dǎo)致黃顙魚種質(zhì)混雜難以避免；又由于棲息地破壞、水質(zhì)污染、過(guò)度捕撈等因素，野生黃顙魚資源日益減少?？紤]到本地黃顙魚遺傳多樣性較低的現(xiàn)狀，相較于其他區(qū)域，長(zhǎng)江、淮河安徽區(qū)段的黃顙魚遺傳多樣性形勢(shì)較為嚴(yán)峻，在黃顙魚種質(zhì)資源保護(hù)上要加以關(guān)注。兩水系間相比較，長(zhǎng)江干流黃顙魚群體遺傳多樣性略高于淮河群體，長(zhǎng)江支流群體的遺傳多樣性水平差別較大，這與當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境條件及人為影響不同有關(guān)。表明長(zhǎng)江干流是安徽本地選育黃顙魚良種的合適產(chǎn)地，應(yīng)當(dāng)加大野生群體的資源保護(hù)。

3.2 黃顙魚群體遺傳分化

群體分化指數(shù)常用來(lái)表示群體間的遺傳分化程度，其值越大則群體間的分化程度越高。當(dāng)群體分化指數(shù)為0～0.05、0.05～0.15、0.15～0.25和0.25～1.00時(shí)，分別表示無(wú)分化、中度分化、遺傳分化較大和遺傳分化極大或高度分化[30]。本研究中黃顙魚地理群體間的總?cè)后w分化指數(shù)為0.2590，屬高度分化；兩兩群體間群體分化指數(shù)為0.0012～0.5975，表明各群體間呈現(xiàn)不同程度的分化，部分群體間遺傳分化顯著。基因交流程度是影響群體結(jié)構(gòu)的重要因素。當(dāng)基因流<1時(shí)，遺傳漂變是影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素；基因流≥4時(shí)，基因流則成為主導(dǎo)因素；1<基因流<4時(shí)，基因流和遺傳漂變均是影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素[31]。本研究中各地理群體間基因流為0.337～416.167，總基因流為1.4305，表明基因流和遺傳漂變?cè)邳S顙魚群體遺傳結(jié)構(gòu)中均發(fā)揮著重要作用。

不同群體間比較可發(fā)現(xiàn)，望江、龍窩湖、無(wú)為和涇縣4個(gè)地理群體間群體分化指數(shù)較低且P>0.05，表明這些群體間遺傳差異不顯著。這是由于除涇縣外，3個(gè)群體樣本均采自長(zhǎng)江干流或近岸水域(龍窩湖)，而涇縣處于長(zhǎng)江下游支流青弋江干流上，該段以下河道寬敞、與長(zhǎng)江干流暢通無(wú)阻，因而群體間基因交流頻繁(基因流>4)、遺傳分化不顯著。另外，長(zhǎng)江下游支流秋浦河上的石臺(tái)群體位于皖南山區(qū)，該地山高溝深、地勢(shì)落差大、河道狹窄多變，地理阻隔較大，因而具有較獨(dú)立的遺傳特點(diǎn)。黃顙魚淮河群體中，瓦埠湖為淮河沿岸湖泊、與鳳臺(tái)距離較近，因而兩群體間無(wú)顯著遺傳差異；阜南和鳳臺(tái)群體樣本雖然均采自干流，但阜南黃顙魚群體采集王家壩上游，大壩的阻隔導(dǎo)致群體間基因交流困難，因此群體間遺傳分化顯著。

庫(kù)喜英等[9]分析了長(zhǎng)江、珠江、遼河、閩江、富春江和韓江6個(gè)水系70尾黃顙魚的遺傳變異，結(jié)果顯示，黃顙魚群體缺乏明顯的地理結(jié)構(gòu)；但又認(rèn)為，27個(gè)單倍型中的26個(gè)均是不同水系的特有單倍型，因此認(rèn)為黃顙魚缺乏顯著的地理結(jié)構(gòu)的狀況已發(fā)生改變。而分子變異分析也顯示，將樣本按照6個(gè)水系劃分為6個(gè)組時(shí)，得到的組間遺傳差異最大；這表明水系的隔離可能限制了群體之間的基因交流，導(dǎo)致不同水系的地理群體產(chǎn)生了不同的變異模式。本研究中長(zhǎng)江、淮河水系黃顙魚群體間的顯著遺傳分化結(jié)果即證明了上述可能性。鐘立強(qiáng)等[10]對(duì)長(zhǎng)江中下游5個(gè)湖泊黃顙魚種群間的遺傳分化結(jié)果也顯示，雖然這些群體間不存在顯著的系統(tǒng)地理格局，但群體間的相對(duì)遺傳距離能反映群體間的親緣關(guān)系；而且一些來(lái)自不同湖泊的黃顙魚群體間存在較大程度的遺傳分化，如洪澤湖與鄱陽(yáng)湖兩群體間遺傳分化系數(shù)為0.21846。另外，珠江水系5個(gè)野生黃顙魚地理群體間的群體分化指數(shù)為0.0260～0.4143，也顯示了同一水系間亦存在顯著的遺傳分化[11]。這與本研究中同一水系不同地理群體間存在明顯遺傳分化的結(jié)果相一致。

以上結(jié)果均說(shuō)明，黃顙魚不同水系間甚至同一水系不同地理群體間存在遺傳分化的現(xiàn)象較為普遍，庫(kù)喜英等[9]“黃顙魚群體缺乏明顯的地理結(jié)構(gòu)”的結(jié)果可能是由一些水系所用樣本過(guò)少引起的，如富春江水系僅有1個(gè)采樣點(diǎn)2個(gè)樣本，遼河僅有2個(gè)采樣點(diǎn)共5個(gè)樣本，閩江僅有3個(gè)采樣點(diǎn)共6個(gè)樣本。

分子變異分析結(jié)果也表明，長(zhǎng)江、淮河水系安徽區(qū)段黃顙魚地理群體間存在著顯著的遺傳分化，這些遺傳分化主要是由不同水系間的群體遺傳差異(變異百分比23.58%)產(chǎn)生的。單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖和群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，黃顙魚8個(gè)地理群體分為2個(gè)大的進(jìn)化枝，長(zhǎng)江、淮河水系群體各為1枝。因此，認(rèn)為水系間的地理阻隔可能是導(dǎo)致這些黃顙魚群體遺傳分化的主要原因。

4 結(jié) 論

長(zhǎng)江、淮河水系安徽區(qū)段黃顙魚群體具有中高度的單倍型多樣性、低的核苷酸多樣性；群體間存在顯著的遺傳分化，這種遺傳分化主要來(lái)源于長(zhǎng)江、淮河兩水系的群體間，表明長(zhǎng)江、淮河水系安徽區(qū)段的黃顙魚具有明顯的地理遺傳結(jié)構(gòu)，分析認(rèn)為不同水系間的地理阻隔可能是導(dǎo)致黃顙魚群體遺傳分化的主要原因。研究結(jié)果為黃顙魚的遺傳管理和資源保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)信息。