查孝柱 ，毛小明 ，徐 源 ，曹 富 ，查光圣 ，姜 莉

（1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽安慶246052；2.安徽光盛農(nóng)業(yè)股份有限公司，安徽安慶246632；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽合肥230001）

齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA）和熊果酸（Ursolic Acid，UA）均為五環(huán)三萜類化合物，是多種中藥含有的活性成分，具有保肝、消炎、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫和抑制免疫等作用［1-2］。目前這2種物質(zhì)還只能從植物中提取，無(wú)法化學(xué)合成，其檢測(cè)方法有分光光度法［3］、薄層掃描法［4］和高效液相色譜法［5-8］。

本課題組將前期含齊墩果酸、熊果酸10種果實(shí)類的HPLC-PDA分析建立了方法，但是含齊墩果酸、熊果酸全草類中藥能否用所建立的方法進(jìn)行分析、常見的全草類中藥含齊墩果酸、熊果酸的含量及分布情況、全草類中藥能否作為提取齊墩果酸或者熊果酸的原料藥等問(wèn)題還鮮見報(bào)道。

本研究以馬鞭草、澤蘭、連錢草以及白花蛇舌草為研究對(duì)象，對(duì)常用含有齊墩果酸和熊果酸4種全草類中藥材進(jìn)行了HPLC-PDA研究，并對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行鑒定比較與分析，為齊墩果酸和熊果酸的提取以及相關(guān)中藥的質(zhì)量控制鑒別提供一定的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

儀器分別為：Agilent1100高效液相色譜儀（包括G1311A泵、G1322脫氣機(jī)、G1313AZ自動(dòng)進(jìn)樣器、G1313A柱溫箱、G1315 DAD及ChemStation色譜工作站）、BP221D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）以及超聲波清洗器等。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)所用藥材樣品來(lái)自安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，經(jīng)安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校姚繩林副教授鑒定，齊墩果酸（批號(hào)：110709-200304）和熊果酸（批號(hào)：110742-200516）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱

1）Shim-pack CLC-ODS （M）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2） 流動(dòng)相為甲醇-水-冰乙酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）；3）檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm；4）柱溫 20 ℃；5）進(jìn)樣量 20 μL；6）理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)應(yīng)不低于7 000；7）齊墩果酸與熊果酸色譜峰及其相鄰峰分離度大于1.68。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品和熊果酸對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含齊墩果酸0.108 mg和熊果酸0.103 mg的混合對(duì)照品溶液，搖勻。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品（馬鞭草、澤蘭、連錢草以及白花蛇舌草）細(xì)粉各約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，用25 mL移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.4 含量測(cè)定

取臨床常用的含有齊墩果酸和熊果酸的4種全草類藥材，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果如表1所示。齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品液HPLC如圖1所示。圖1中a為齊墩果酸，b為熊果酸。

表1 4種全草類中藥中齊墩果酸和熊果酸的百分含量（n=2）

圖1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液HPLC

3 討論

3.1 不同全草類中藥中齊墩果酸和熊果酸含量比較

表1表明，4種全草類中藥中都同時(shí)存在齊墩果酸和熊果酸，但含量高低存在明顯差異。

馬鞭草和澤蘭齊墩果酸、熊果酸總含量較高，齊墩果酸含量最高的是白花蛇舌草，熊果酸含量最高的是馬鞭草。因此，以提取齊墩果酸為目的，可以選擇白花蛇舌草；以提取熊果酸為目的，可以選擇馬鞭草；以提取總?cè)扑釣槟康?，可以選擇馬鞭草和澤蘭。

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)還有待進(jìn)一步考察不同品種、產(chǎn)地、采收時(shí)間及炮制方法等因素的影響，研究的中藥材有待加大樣品批次進(jìn)一步研究。

3.2 不同全草類中藥HPLC色譜圖比較

澤蘭、馬鞭草、連錢草及白蘭蛇舌草4種全草類中藥材HPLC如圖2所示。

圖2顯示，在所用的提取、分離和檢測(cè)條件下，4種所測(cè)的全草類中藥材除了有齊墩果酸和熊果酸峰之外，各色譜圖中峰數(shù)、峰位和峰強(qiáng)度表現(xiàn)出一定的可區(qū)分性，可用該方法鑒別這4種全草類藥材，各樣品的鑒別特征有待增加同種樣品批數(shù)作進(jìn)一步研究。

圖2 4種全草類中藥材HPLC

3.3 色譜條件的選擇

在對(duì)全草類中藥材齊墩果酸與熊果酸的分離檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，分別對(duì)流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水），緩沖對(duì)（氫氟酸、磷酸、冰乙酸、三乙胺），檢測(cè)波長(zhǎng)（200、205、210、215、220 nm），流速（0.4、0.6、1 mL/min）進(jìn)行考察，最終確定最佳的色譜條件為：流動(dòng)相甲醇-水、緩沖對(duì)冰乙酸、三乙胺、檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm、流速0.6 mL/min。

實(shí)驗(yàn)表明，在所確定最佳的色譜條件下，齊墩果酸與熊果酸之間分離度均較好（R＞1.68）；理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)應(yīng)不低于7 000，也達(dá)到規(guī)定要求；齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間分別為27.9和29.3 min。

3.4 提取條件的選擇

在對(duì)全草類中藥材齊墩果酸、熊果酸提取的過(guò)程中，分別考察了不同溶劑（甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚）、不同體積比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）、不同提取方式（回流、索氏提取、超聲、冷浸）、不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min），最終確定全草類中藥齊墩果酸、熊果酸的最佳提取工藝為：取約0.5 g馬鞭草、澤蘭、連錢草以及白花蛇舌草粉末，用25 mL甲醇提取30 min。

4 小結(jié)

本研究采用反相高效液相色譜法建立了全草類中藥材齊墩果酸與熊果酸含量的測(cè)定鑒定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為全草類中藥齊墩果酸、熊果酸含量的測(cè)定鑒定方法。從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，建議如果以提取齊墩果酸為目的時(shí)就選擇白花蛇舌草，如果以提取熊果酸為目的時(shí)就選擇馬鞭草，如果以提取總?cè)扑釣槟康臅r(shí)就選擇馬鞭草和澤蘭。