趙迎春, 李勇

1蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院甲狀腺乳腺外科(安徽蕪湖 241000)； 2蕪湖市第二人民醫(yī)院病理科(安徽蕪湖 241000)

臨床中甲狀腺惡性腫瘤最常見的是乳頭狀癌，甲狀腺乳頭狀癌包含數(shù)種組織亞型并且預(yù)后較好[1]。但不同組織亞型的甲狀腺乳頭狀癌具有不同的生物學(xué)侵襲行為，尤其在最常見的經(jīng)典型及濾泡型甲狀腺乳頭狀癌中，其轉(zhuǎn)移的機(jī)制并未完全了解。而血管生成及淋巴管生成是腫瘤進(jìn)展過程中最基本的步驟，并反映了腫瘤微環(huán)境的基本特征。血管生成為腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)，而淋巴管生成則為腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了便利的通路[2]，在腫瘤的血管生成及淋巴管生成過程中有重多的調(diào)控因子，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是調(diào)控腫瘤血管生成及淋巴管生成的重要刺激因子，并且能夠調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖及遷移[3]。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)能夠調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄，因而能夠上調(diào)VEGF的表達(dá)。有研究表明，在腫瘤中COX-2能夠增加瘤體的血管密度，促進(jìn)腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移[4]。p27是周期素依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑，主要調(diào)控細(xì)胞周期G1向S期的轉(zhuǎn)變，研究表明p27的表達(dá)在多種腫瘤的診斷與預(yù)后中都起到重要的指導(dǎo)作用[5]。甲狀腺乳頭狀癌雖然具有較好的預(yù)后，但其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高，各種亞型腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。本研究的目的主要探討VEGF、COX-2及p27在各種甲狀腺亞型中表達(dá)的差異及對于腫瘤血管生成和淋巴管生成的影響，從而進(jìn)一步揭示不同亞型甲狀腺腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院甲乳外科2017年1月至2019年12月收治的共69例可切除原發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌患者的資料納入本研究?；颊吣挲g23～68歲，其中年齡<50歲者21例(30.4%)，≥50歲者48例(69.6%)，中位年齡56歲。所有原發(fā)腫瘤的直徑按照TNM分期系統(tǒng)分為≤2 cm為pT1期、2～4 cm為pT2期及>4 cm為pT3期，pT1共有44例，pT2有15例，pT3有10例。按照WHO病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)有40例診斷為經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌，有29例診斷為濾泡型甲狀腺乳頭狀癌。將年齡≥50歲且有包膜浸潤的患者歸為高危組，其余為低危組。所有患者均行一側(cè)甲狀腺腺葉切除或甲狀腺全切合并區(qū)域淋巴結(jié)清掃。另采用12例甲狀腺良性疾病標(biāo)本作為對照，石蠟包埋組織標(biāo)本。

1.2 免疫組化染色 69例甲狀腺癌與12例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織蠟塊均行4 μm連續(xù)切片，分別作HE和免疫組織化學(xué)染色。鼠抗人單克隆抗體VEGF、COX-2、p27、D2-40及CD31抗體等相關(guān)試劑均購自福州邁新公司。免疫組化染色按照說明書步驟進(jìn)行。經(jīng)DAB顯色后，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽性切片作陽性對照，PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF、COX-2及p27蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞的胞漿或胞核，呈棕黃色顆粒，選取5個高倍鏡(×400)視野做陽性細(xì)胞計數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性，>10%為陽性。而微血管密度(MVD)及淋巴管密度(LVD)以CD31或D2-40染色以陽性著色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇計數(shù)，以微管或脈管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片由2 名病理醫(yī)師分別計數(shù)LVD及MVD，在雙盲法下進(jìn)行。參照Weidner[6]的方法對MVD及LVD進(jìn)行分別統(tǒng)計，先在40倍光鏡下確定5個著色密集的區(qū)域(hotspot)，200倍光鏡下分別計數(shù)5個視野，取其均值。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、COX-2及p-27在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá) 本組病例中甲狀腺癌組織中VEGF的陽性表達(dá)率為52.2%，COX-2的陽性表達(dá)率為46.4%，p27的陽性表達(dá)率為28.9%，在甲狀腺良性病變中VEGF、COX-2 及p27的陽性率分別為16.7%、8.3%、33.3%，甲狀腺癌組織中VEGF、COX-2陽性表達(dá)率明顯高于甲狀腺良性病變組織 (P<0.01)，而p27的表達(dá)兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腫瘤組織中VEGF的表達(dá)、COX-2及p27的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤最大徑、脈管內(nèi)侵犯及包膜外侵犯無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。但VEGF在經(jīng)典甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)陽性率明顯高于濾泡型乳頭狀癌(P<0.05)。在年齡≥50歲的甲狀腺乳頭狀癌中，VEGF的表達(dá)隨腫瘤最大徑的增大而明顯升高(P=0.04)，見圖1；而在<50歲的患者中，VEGF的表達(dá)與腫瘤最大徑無明顯相關(guān)性(P>0.05)。雖然VEGF、COX-2的表達(dá)與相關(guān)臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性，但本組病例按照VEGF及COX-2的表達(dá)細(xì)分為VEGF(-)/COX-2(-)、VEGF(-)/COX-2(+)、VEGF(+)/COX-2(-)及VEGF(+)/COX-2(+)四個亞組時發(fā)現(xiàn),VEGF、COX-2表達(dá)的共同升高與腫瘤的脈管內(nèi)侵犯密切相關(guān)(P=0.035)，見圖2。

2.2 MVD、LVD與甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系 D2-40及CD31的在甲狀腺癌中陽性表達(dá)見圖3。MVD與患者的年齡、性別、腫瘤最大徑、COX-2的表達(dá)、p27的表達(dá)無關(guān)(P>0.05),但與風(fēng)險的高低、脈管內(nèi)侵犯、腫瘤包膜外侵犯及VEGF的表達(dá)密切相關(guān)(P<0.05)。而LVD與患者的年齡、性別、腫瘤最大徑、VEGF、COX-2及p27的表達(dá)、風(fēng)險的高低、腫瘤包膜外侵犯等無關(guān)，但與組織亞型密切相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)在濾泡型甲狀腺癌中COX-2的表達(dá)與LVD密切相關(guān)(P<0.05)，見表2。分析MVD在預(yù)測脈管內(nèi)浸潤中的作用，繪制受試者工作曲線(ROC)發(fā)現(xiàn)MVD>6.52時預(yù)測脈管內(nèi)浸潤敏感度達(dá)到79.41%，特異度達(dá)到83.79%，見圖4。

表1 VEGF、COX-2、p27與臨床病理因素的關(guān)系 例

圖1 不同年齡中VEGF的陽性表達(dá)率與腫瘤直徑的關(guān)系

圖2 VEGF與COX-2的共表達(dá)與脈管內(nèi)浸潤的關(guān)系

注：A：D2-40在甲狀腺癌中的陽性表達(dá)，箭頭所示為淋巴管；B：CD31在甲狀腺癌中的陽性表達(dá)，箭頭所示為微血管

表2 LVD、MVD與甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系

圖4 ROC曲線顯示MVD預(yù)測脈管內(nèi)浸潤的敏感度與特異度

2.3 不同亞型甲狀腺乳頭狀癌血管、LVD的差異 LVD與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理因素?zé)o明顯的相關(guān)性(P>0.05),但在濾泡型甲狀腺乳頭狀癌中LVD(9.13±1.78)明顯高于MVD(5.73±1.25)(P<0.05)，也高于經(jīng)典型甲狀腺癌的LVD(7.82±1.46)(P<0.05)，且濾泡型甲狀腺乳頭狀癌中LVD與脈管內(nèi)侵犯密切相關(guān)(P<0.05)。經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌中兩者的密度卻差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但濾泡型甲狀腺乳頭狀癌的MVD明顯低于經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌(P<0.05)，而且經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌的VEGF的陽性表達(dá)率(65.0%)明顯高于濾泡型甲狀腺乳頭狀癌(34.5%)(P<0.05)，但在濾泡型甲狀腺乳頭狀癌中COX-2的表達(dá)與P27的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.455，P<0h05)，在經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌中兩者的表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

甲狀腺癌的進(jìn)展主要依賴于腫瘤血管生成的程度[7]。與以往的研究相同，本研究發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組、包膜外侵犯及脈管侵犯的甲狀腺癌具有更高的MVD，而MVD預(yù)測甲狀腺癌發(fā)生脈管侵犯的敏感度達(dá)到79.41%，特異度達(dá)到83.79%。而在甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGF的表達(dá)與MVD及腫瘤的大小密切相關(guān)，且VEGF與COX-2的共表達(dá)與脈管內(nèi)侵犯密切相關(guān)，說明VEGF與COX-2在乳頭狀癌中可能共同調(diào)控了腫瘤的生長及腫瘤微血管的密度。但是作為腫瘤的異質(zhì)性，不同亞型的甲狀腺乳頭狀癌血管生成及淋巴管生成的機(jī)制并不完全相同。在濾泡性甲狀腺乳頭狀癌中，LVD明顯高于MVD，而在經(jīng)典甲狀腺乳頭狀癌中，兩者的密度并無差異；另外與經(jīng)典乳頭狀癌相比，濾泡性乳頭狀癌的MVD相對降低，但LVD卻明顯升高。相應(yīng)地在濾泡性乳頭狀癌中VEGF的陽性表達(dá)率也明顯低于經(jīng)典乳頭狀癌。進(jìn)一步證實在經(jīng)典型乳頭狀癌中VEGF可能在血管生成方面起到重要的調(diào)控作用，而在濾泡型乳頭狀癌中COX-2與p27在調(diào)控淋巴管生成方面起到重要的調(diào)控作用。

脈管內(nèi)及包膜外侵犯是體現(xiàn)甲狀腺侵襲性的重要標(biāo)志[8]，腫瘤發(fā)生脈管內(nèi)侵犯后使得腫瘤細(xì)胞更易通過血管或淋巴管進(jìn)行播散，使得腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)MVD與脈管內(nèi)侵犯，包膜外侵犯密切相關(guān)，而且與高危組甲狀腺癌密切相關(guān)。Alitalo等[9]研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌中MVD越高，患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險越大，無病生存期也會越短，這也進(jìn)一步證實了本研究的結(jié)果。

大量研究表明，VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)在進(jìn)展期甲狀腺癌原發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移灶中都明顯升高[10]，而且VEGF mRNA的表達(dá)隨著腫瘤的增大會明顯升高。與上述研究的結(jié)論相同，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF的陽性表達(dá)率在甲狀腺乳頭狀癌中明顯升高，但其與腫瘤病灶的直徑，包膜侵犯及脈管內(nèi)侵犯等臨床病理因素并無明顯關(guān)系，但VEGF的表達(dá)與MVD密切相關(guān)，而且在50歲以上患者中VEGF的表達(dá)隨腫瘤的增大明顯增加，pT3腫瘤中的VEGF陽性表達(dá)率最高，提示可能隨著腫瘤的增大腫瘤內(nèi)缺氧及酸性的環(huán)境刺激腫瘤大量分泌VEGF的表達(dá)，從而為腫瘤的生長提供更多的血供。但COX-2的表達(dá)與MVD及相關(guān)的臨床病理因素并無明顯相關(guān)性，提示在甲狀腺乳頭狀癌的血管生成中，可能VEGF起到了重要的調(diào)控作用。

淋巴管生成對于腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及全身轉(zhuǎn)移的發(fā)生起到重要的促進(jìn)作用，既往大量研究表明[11]淋巴管生成因子VEGF-C的表達(dá)與LVD與甲狀腺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究也表明VEGF與COX-2的共表達(dá)與脈管浸潤密切相關(guān)，提示VEGF或COX-2可能共同促進(jìn)了腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。

研究表明[12],濾泡型甲狀腺乳頭狀癌與經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌在形態(tài)及臨床表現(xiàn)方面都完全不同，本研究發(fā)現(xiàn)兩者在血管生成及淋巴管生成方面也存在較大的差異性。這與Lang等[13]的研究結(jié)論相同，說明在不同的甲狀腺癌組織亞型中血管生成與淋巴管生成在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展中可能起到完全不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在濾泡型乳頭狀癌中COX-2的高表達(dá)常常伴隨著p27的低表達(dá)及LVD的增加。這可能與COX-2的表達(dá)上調(diào)了前列腺素E2的表達(dá)，而前列腺素E2的表達(dá)能夠促進(jìn)p27的磷酸化，從而促使p27降解而使得淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖，因此在濾泡型乳頭狀癌中COX-2與p27的表達(dá)對調(diào)控LVD起到重要的作用。但在經(jīng)典甲狀腺乳頭狀癌中，VEGF的高表達(dá)與MVD密切相關(guān)，提示在經(jīng)典甲狀腺乳頭狀癌中VEGF的表達(dá)對MVD起到重要的調(diào)控作用。

綜上所述，在不同組織亞型的甲狀腺乳頭狀癌中血管生成與淋巴管生成可能在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮不同的作用，而VEGF、COX-2及p27在腫瘤的血管生成及淋巴管生成中也起到不同的調(diào)控作用。在經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌中VEGF的高表達(dá)可能促進(jìn)了血管生成作用，使得腫瘤更易生長與轉(zhuǎn)移；而在濾泡型甲狀腺乳頭狀癌中COX-2的高表達(dá)降解了p27的表達(dá)，促進(jìn)了淋巴管的大量生成從而使得腫瘤更易發(fā)生浸潤與轉(zhuǎn)移。理解不同亞型腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的不同機(jī)制，為腫瘤的個體化治療提供了理論依據(jù)，也為將來的靶向治療提供了新的作用靶點。