孫小虎, 王璐, 劉春娜, 張文陸△

1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科(遼寧錦州 121001)； 2遼寧省腫瘤醫(yī)院病理科(遼寧沈陽 110042)

近年來，消化系統(tǒng)腫瘤越來越常見，其中食管癌(EPC)作為常見的消化道腫瘤之一，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并且患病人群趨于年輕化[1]。EPC的早期診斷、早期治療對(duì)EPC患者的預(yù)后至關(guān)重要。目前，手術(shù)切除療法、放射治療和化學(xué)藥物治療方法是EPC的主要治療手段，但仍有部分患者出現(xiàn)手術(shù)后的復(fù)發(fā)或并發(fā)癥，而且很多化療藥物治療過程中，有多種不良反應(yīng)，甚至患者不能耐受其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而放棄治療[2]。由于以上治療EPC中的諸多不足之處，因此，尋找安全有效的EPC的治療手段，已經(jīng)成為急需解決的主要問題。為補(bǔ)充EPC治療中的不足，綜合治療手段已是治療EPC常用而有效的治療方法。新近的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥黃芪(Astragalus，AGs)的有效成分黃芪多糖(APS)在EPC的綜合治療中發(fā)揮重要的作用，特別是減少術(shù)后并發(fā)癥作用尤為顯著。研究表明，一些炎癥因子及炎癥細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、髓系細(xì)胞觸發(fā)受體(TREM-1)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)可能激活下游信號(hào)通路，觸發(fā)后續(xù)的病理生理學(xué)效應(yīng)，參與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展，如EPC、結(jié)腸癌等，并可能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后[3-4]。但APS對(duì)EPC治療作用，特別是對(duì)炎癥因子是如何影響，以及在治療EPC中的可能信號(hào)機(jī)制，目前仍少見報(bào)道。為了更好地研究EPC的早期診斷及綜合治療，本研究采用ELISA方法測(cè)定多種炎癥因子的含量變化，另采用Western blot方法定量檢測(cè)TREM-1及EGFR在EPC及癌旁組織中的表達(dá)，并檢測(cè)AKT、p-AKT，以探討APS糖對(duì)EPC保護(hù)作用新的信號(hào)通路機(jī)制。為EPC的早期診斷提供依據(jù)，如檢測(cè)TREM-1和EGFR，可為EPC的早期檢出率提供實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，為EPC的治療提供新的有效輔助治療方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月來院就診的EPC患者20例為單純手術(shù)治療組(EPC組)；另選取EPC患者20例，手術(shù)前7 d，征得患者同意給予APS治療，為藥物治療組(APS組)。同時(shí)選取其相應(yīng)癌旁組織(EPC邊緣外≥5 cm)共20例作為空白對(duì)照組(TAEC組)。上述入組的EPC患者，均簽署知情同意書。上述所有的受試病例均無重復(fù)，且各受試臨床病理資料均完整。各組患者的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。見表1。

表1 各組EPC患者臨床資料比較 例

1.2 試驗(yàn)藥品 黃芪多糖注射液(250 mg/支，天津賽諾制藥有限公司生產(chǎn))；白細(xì)胞介素(IL)-12、IL-6及VEGF測(cè)定試劑盒(碧云天生物公司)，TREM-1抗人單克隆抗體(ab214202，英國(guó)Abcam公司)；兔抗人AKT、p-AKT單克隆抗體(Cell Signal Technology 公司)。

1.3 給藥及標(biāo)本處理 APS治療組患者術(shù)前征得患者同意后，每天給予APS(1 mg/ kg)藥物治療，給藥時(shí)程為7 d。7 d后進(jìn)行手術(shù)切除治療。EPC組未給以APS輔助治療，采用單純手術(shù)治療。手術(shù)后收集上述各受試組中EPC組織進(jìn)行病理觀察，離體30 min內(nèi)進(jìn)行處理。具體操作方法：在上述患者手術(shù)腫瘤食管部位，切取面積約1.0 cm×1.0 cm的食管組織作為受試組織。取出的食管組織即用生理鹽水(NS)進(jìn)行漂洗，備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 觀察術(shù)后一般狀態(tài) APS治療給藥期間及手術(shù)切除后，記錄各組受試EPC患者行為活動(dòng)，精神狀態(tài)等，并觀察術(shù)后是否出現(xiàn)并發(fā)癥(如術(shù)后胃腸道反應(yīng)、出血等)。

1.4.2 炎癥及細(xì)胞因子的測(cè)定 各組EPC患者手術(shù)結(jié)束后，按照上述食管標(biāo)本取材要求，選取腫瘤及腫瘤旁組織，取各組受試食管組織的勻漿，采用ELISA 法測(cè)定炎癥因子的含量變化，包括測(cè)定IL-12、IL-6及VEGF的含量，以及TREM-1及EGFR的含量變化。

1.4.3 SP免疫組化炎癥因子的測(cè)定 另取一部分EPC組織經(jīng)過脫蠟、梯度酒精脫水、抗原修復(fù)后滴加一抗和二抗，經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染后，在400倍光鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)視野，根據(jù)細(xì)胞染色部位，進(jìn)行染色密度和染色強(qiáng)度結(jié)果評(píng)分。判定Trem-1和EGFR結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為，>2分者為染色陽性，≤2分者為染色陰性。具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：染色面積評(píng)估：0分：無陽性染色細(xì)胞；1分：≤25%；2分：26%～50%；3分：51%～100%。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分：陽性細(xì)胞無著色；1分：陽性細(xì)胞淡黃色；2 分：呈現(xiàn)染色特性為棕黃色；3分：棕褐色。細(xì)胞膜(CM)評(píng)分：0分<10% CM染色；1分：≥10% CM微弱染色；2分：≥10%側(cè)膜、基底側(cè)膜中度染色；3分：≥10%細(xì)胞強(qiáng)染色出現(xiàn)在側(cè)膜、基底膜。上述評(píng)分之和用來判斷TREM-1和EGFR 染色結(jié)果。

1.4.4 采用Western blot方法測(cè)定各組受試結(jié)腸組織中AKT和p-AKT的蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)中各受試組中分別加入AKT、p-AKT、β-actin。采用 ECL試劑法進(jìn)行顯色，應(yīng)用Image Quant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)獲得掃描圖像，根據(jù)Image J軟件分析條帶灰度值，并與內(nèi)參比較，用以計(jì)算AKT、p-AKT的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)后一般狀況 EPC組及TAEC組中患者術(shù)后有40%的患者出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥，如消化道癥狀、傷口出血、傷口愈合延遲等。APS組上述癥狀明顯改善，各患者術(shù)后未見切口部位出血、感染和預(yù)后延遲，APS組中EPC患者的一般狀態(tài)有緩解，較EPC組近期并發(fā)癥明顯降低，見表2。

表2 各組手術(shù)后2周內(nèi)并發(fā)癥發(fā)生率的比較 例(%)

2.2 IL-12及IL-6的炎癥因子及VEGF含量測(cè)定 與TAEC組相比，EPC組受試患者食管組織中，炎癥因子IL-6 及IL-12明顯升高，炎癥細(xì)胞因子VEGF也升高(P<0.01)，而術(shù)前7 d應(yīng)用APS的食管癌患者，上述炎癥因子及炎癥細(xì)胞因子結(jié)果顯著下降，與EPC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組手術(shù)后IL-12、IL-6和VEGF的比較

2.3 TREM-1及EGFR的炎癥細(xì)胞因子含量測(cè)定 EPC組的食管組織中，細(xì)胞因子TREM-1及EGFR明顯升高，EPC組及APS組與TAEC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，術(shù)后APS組與EPC組相比，上述炎癥性胞因子結(jié)果顯著下降(P<0.05);APS組與EPC組相比，上述炎癥細(xì)胞因子也均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組手術(shù)后TREM-1和EGFR的比較

2.4 TREM-1及EGFR在EPC及癌旁組織中表達(dá) SP免疫組化結(jié)果顯示，在TAEC組的癌旁組織中TREM-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，其陽性表達(dá)率降低，EPC組和APS組食管癌組織中表達(dá)均升高，與TAEC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在EPC組的EPC組織中，TREM-1及EGFR陽性定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)，陽性表達(dá)常見，每張切片取十個(gè)視野，陽性表達(dá)率明顯升高。在APS組中，TREM-1陽性染色也可見，陽性表達(dá)率也升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TAEC組的癌旁組織中相比，EPC組和APS組EPC組織中的EGFR的表達(dá)也明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在EPC組的EPC組織中，EGFR陽性率高于APS給藥組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～2、表5。

注：A：EPC組；B：APS組；C：TAEC組

注：A：EPC組；B：APS組；C：TAEC組

表5 各組手術(shù)后炎癥因子的陽性表達(dá)率比較 %

2.5 食管腫瘤組織中AKT和p-AKT的蛋白表達(dá) 與TAEC組相比，APS組和EPC組食管腫瘤組織中的PKB蛋白表達(dá)量明顯升高，而p-AKT含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與EPC組相比，APS組及TAEC組AKT蛋白表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6及圖3。

表6 各組手術(shù)后食管組織中AKT、p-AKT的影響(OD值)

圖3 各組中AKT及p-AKT蛋白表達(dá)的影響

3 討論

EPC是較為常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率逐年升高且趨于年輕化。目前，EPC仍以手術(shù)治療作為最有效的治療手段，但單純的手術(shù)治療并非最有效手段，其術(shù)后仍有可能出現(xiàn)諸多并發(fā)癥甚至導(dǎo)致EPC復(fù)發(fā)。因此，手術(shù)結(jié)合藥物治療的綜合療法突顯出重要性，其中傳統(tǒng)中藥的輔助治療同時(shí)結(jié)合手術(shù)治療，已成為治療EPC的新的最佳手段[1-2]。

新近的研究報(bào)道表明，傳統(tǒng)中藥黃芪的有效成分APS在EPC的綜合治療中發(fā)揮重要的輔助治療作用，特別是在減少EPC術(shù)后并發(fā)癥作用尤為顯著。APS具有良好的抗氧化、抗缺血、抗腫瘤及提高機(jī)能免疫能力等多重藥理作用。APS是研究較早的多糖類，新近的研究發(fā)現(xiàn)可用于減輕腫瘤手術(shù)后、放療以及化療期間引起的不良反應(yīng)，可以作為腫瘤治療的輔助用藥，特別是用于消化道腫瘤，如EPC的輔助治療[5-6]。

IL-12 及IL-6是存在于多種組織和細(xì)胞內(nèi)的較為常見的炎癥因子，兩者參與并誘發(fā)了多種炎癥反應(yīng)，并可能觸發(fā)了隨后的免疫炎癥反應(yīng)。另外VEGF也證實(shí)誘導(dǎo)多種疾病(包括腫瘤)的發(fā)生與發(fā)展，如EPC、結(jié)腸癌等[7-8]。在本研究中，應(yīng)用APS的EPC術(shù)后患者，一般狀態(tài)良好，術(shù)后并發(fā)癥減輕。提示APS對(duì)EPC術(shù)后有一定輔助治療作用。IL-12 及IL-6是炎癥細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)的免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的生物活性的炎癥因子，藥物能降低IL-12 及IL-6則能抑制炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，APS能明顯降低炎癥因子IL-12、IL-6及VEGF的含量，提示APS能通過降低IL-12、IL-6及VEGF的含量，降低EPC術(shù)后的炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步說明了APS是通過減少局部炎癥因子減輕手術(shù)切口局部的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合，降低并發(fā)癥。

TREM-1是2000年才發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新型炎癥效應(yīng)及細(xì)胞調(diào)控因子[9-10]。TREM-1選擇性表達(dá)于中性粒細(xì)胞(neutrophils)和CD14炎癥單核細(xì)胞，參與急性炎癥反應(yīng)，在正常的消化道組織中存在弱的陽性表達(dá)。表皮生長(zhǎng)因子受體，EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體(transmembrane tyrosine kinase receptor)，是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物之一，研究已經(jīng)證實(shí)其參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)過程[11-12]。在本研究中，率先證明了APS能明顯降低炎癥細(xì)胞因子TREM-1和EGFR含量及陽性表達(dá)，該結(jié)果提示APS在EPC的輔助治療中可能通過降低TREM-1和EGFR含量，發(fā)揮其對(duì)EPC的治療及預(yù)防作用。新近的研究表明，多種炎癥反應(yīng)可能上調(diào)TREM-1在炎癥細(xì)胞表面促進(jìn)可溶性亞型——sTREM-1的胞外分泌及表達(dá)[9,13]。本研究中APS不僅能降低炎癥細(xì)胞因子TREM-1和EGFR的含量，而且能降低TREM-1和EGFR在食管組織中的陽性表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了APS對(duì)EPC的治療及預(yù)防作用是通過降低炎癥細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的，也提示APS可能作為一種酪氨酸激酶抑制劑發(fā)揮其對(duì)EPC及相關(guān)消化道腫瘤的輔助治療作用。本研究率先闡明了TREM-1和EGFR的表達(dá)及含量測(cè)定可以用于EPC的早期診斷，將提高EPC的早期檢出率，并能提高患者的治愈率，降低患者的復(fù)發(fā)率。

pAKT-AKT信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中出現(xiàn)異?；罨?， AKT信號(hào)通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及凋亡中至關(guān)重要，該信號(hào)通路對(duì)蛋白質(zhì)和葡萄糖代謝也發(fā)揮重要作用[14]。在本研究Western blot的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，APS能減低食管腫瘤組織中的AKT蛋白表達(dá)水平，升高p-AKT水平。AKT是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，多項(xiàng)研究已證實(shí)了AKT參與多種生理以及病理活動(dòng)[15]，本研究的這部分結(jié)果提示，APS可能是通過下調(diào)p-AKT-AKT信號(hào)途徑，進(jìn)而下調(diào)多種炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，在EPC，乃至多種消化道疾病中發(fā)揮治療及預(yù)防的作用。

綜上所述，APS對(duì)EPC的防治作用可能是影響p-PKA-PKA信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)下游的多種炎癥因子(如TREM-1、EGFR、IL-12、IL-6及VEGF)，TREM-1和EGFR的表達(dá)及含量測(cè)定可以用于EPC的早期診斷，APS將成為治療與預(yù)防EPC的新的藥物作用靶點(diǎn)，因此對(duì)APS機(jī)制的深入研究，將有可能為以后腫瘤的研究、治療提供新的思路和方法。