張秀冰, 施高慧, 陳明暉, 丁晨暉, 蔡炳, 陸寶敏, 劉瑜亮, 徐艷文

中山大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心(廣東廣州 510080)

隨著中國二胎時代的到來，越來越多的不孕患者為高年齡女性(產(chǎn)科定義為年齡≥35歲)，需尋求輔助生殖技術。高齡婦女卵巢儲備功能明顯下降，獲得卵子數(shù)少，受精率較低[1],周期取消率高[2]，如何提高卵巢反應不良患者的卵子利用率，獲得可利用胚胎是目前臨床關注的熱點問題，而卵子授精方式的選擇是其關鍵點。目前體外授精的方式有常規(guī)體外授精(IVF)和單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射(ICSI)兩種。1992年世界首例ICSI成功應用于男方因素不育[3]。之后有報道指出ICSI不但對于男性因素，也可用于前次受精率低的不孕患者，而且還能降低多精受精率[4-5]，并且ICSI的運用指征越來越廣泛[6]。然而與常規(guī)IVF相比，ICSI是否能提高胚胎質(zhì)量、胚胎種植以及獲得更好的臨床結(jié)局，尚無定論[7-8]，特別是對卵子數(shù)量極少的患者，運用哪種方式授精更適合,目前尚有爭議[9-10]。因此，本研究回顧性分析僅獲得單個卵子的取卵周期在不同授精方式下的各項胚胎參數(shù)和臨床結(jié)局，為臨床選擇授精方式提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2012年9月至2016年11月在中山大學附屬第一醫(yī)院生殖中心接受治療，每周期只獲得單個卵子并通過IVF或ICSI授精的525例患者共777個周期。根據(jù)精液質(zhì)量情況將其分為3組：IVF組(n=563)，嚴重男方因素(severe male factor, SMF)-ICSI組(n=151)和非嚴重男方因素(non-severe male factor， NSMF)-ICSI組(n=63)。不孕病因包括：卵巢功能衰退、盆腔及輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、不明原因不孕、排卵障礙、男方少弱畸精癥等。本研究已通過我院臨床科研和實驗動物倫理委員會批準，已簽知情同意。

1.2 控制性促排卵方案 根據(jù)患者本身的卵巢儲備情況選擇不同的促排卵方案，啟動劑量根據(jù)患者的年齡，基礎卵泡刺激素水平，基礎竇卵泡數(shù)等決定。陰道超聲和激素水平監(jiān)測卵泡發(fā)育，當1個主導卵泡直徑≥18 mm或2個優(yōu)勢卵泡直徑≥17 mm 時，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 000 U。34～36 h后超聲引導下取卵。

1.3 精液處理 患者取卵當天，丈夫通過手淫取精并將精液放置到無菌的取精杯中，根據(jù)WHO第5版精液處理方法，IVF精液處理為梯度離心加上游法，授精濃度調(diào)為1×106·mL-1。ICSI精液處理為上游法。

1.4 ICSI的適應證 3次檢查內(nèi)至少有2次以上精液常規(guī)符合以下任一標準者：(1)重度少精子癥，兩次檢查精液密度<5×106·mL-1；(2)重度弱精癥，精液密度>15×106·mL-1，向前運動精子率<5%；(3)重度畸精癥，精子正常形態(tài)率<1%；(4)精子頂體反應率<5%；(5)一次射精的活動精子總數(shù)<1.5×106·mL-1；(6)處理后的精液密度<1×106·mL-1；(7)前次IVF受精率<30%或完全受精失??；(8)冷凍精子后解凍復蘇為少弱精子。NSMF組的精液常規(guī)分析：處理后的精液密度<1×106·mL-1；前次IVF受精率<30%或完全受精失敗；反復IVF失敗；冷凍精子后解凍復蘇為少弱精子。SMF組精液常規(guī)分析：重度少精子癥；重度弱精癥；重度畸精癥；精子頂體反應率<5%；一次射精的活動精子總數(shù)<1.5×106條。

1.5 受精觀察及胚胎評分 IVF授精時間為取卵后4～6 h，ICSI為取卵后2～4 h，16～20 h后觀察受精情況，觀察到兩個原核(2PN)和兩個極體為正常受精。受精后D3進行卵裂期胚胎評分，根據(jù)SART評分標準:細胞數(shù)量、對稱性、碎片比例3個指標來評估胚胎的優(yōu)劣。

可移植胚胎為4細胞或4細胞以上，卵裂球大小均一或中度不均，碎片為<25%；優(yōu)質(zhì)胚胎為6～9細胞，卵裂球大小均一或中度不均，碎片為≤10%。第5～6天囊胚的評分根據(jù)Gardner評分方法進行，從囊胚的擴張狀態(tài)，內(nèi)細胞團和外滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育對囊胚進行評估?？梢浦驳呐咛?BB及以上囊胚，優(yōu)質(zhì)囊胚為第5～6天囊胚評分為3～6期,內(nèi)細胞團和外滋養(yǎng)評分在BB或BB以上(3BB/3AA/4BB/4AA/5BB/5AA/6BB/6AA)。

1.6 各項觀察指標 成熟卵子率(MⅡ)、正常受精率(2PN) 、異常受精率(MPN)、卵子退化率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、每周期臨床妊娠率。

1.7 玻璃化冷凍及解凍方法 D3卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷凍：采用玻璃化冷凍試劑盒(Kitazator,日本),操作按說明書進行，具體的過程參照Kuwayama 等的方法。復蘇胚胎時將胚胎從液氮中迅速取出并放入含有1 mol/L蔗糖的(1)液(37℃)中平衡1 min，再轉(zhuǎn)入含0.5 mol/L 蔗糖(2)液中平衡3 min,之后移入含0.25 mol/L蔗糖的(3)平衡液中平衡3 min，再轉(zhuǎn)入無含蔗糖平衡液(4)平衡3 min，最后再重復移入另一無含蔗糖平衡液(4)中3 min。

1.8 臨床妊娠指標 觀察新鮮周期移植為取卵后的第3天或第5～6天進行胚胎移植，常規(guī)的黃體支持。解凍周期在是自然周期(NC)或人工替代周期(HRT)，移植后12～14 d檢測尿的HCG和血的HCG水平，陽性者為生化妊娠。6～7周下B超下觀察到有孕囊為臨床妊娠。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,多組資料均數(shù)比較采用方差分析,各種率的比較采用2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。當P<0.05差異有統(tǒng)計學意義時，采用Bonferroni校正法進行3組樣本間兩兩比較，P=0.016 7。

2 結(jié)果

2.1 3組基本資料比較 3組的基本情況如表1所示，3組的年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎FSH、卵泡總數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？傊芷跀?shù)(即包括在外院和本院進行的促排周期總和)的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，NSMF-ICSI組的平均總周期數(shù)為5.6±4.5，明顯高于IVF組(3.2±2.7)和SMF-ICSI組(3.2±2.1)。

表1 患者的基本資料比較

2.2 3組胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較 本研究僅納入在本院進行的促排周期777個。3組間IVF組卵子成熟率(MⅡ)為94.8%，顯著高于ICSI-SMF組的85.4%和NSMF-ICSI組90.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步對3組數(shù)據(jù)進行兩兩比較，IVF組卵子成熟率顯著高于ICSI-SMF組，P=0.00<0.016 7。SMF-ICSI組(81.4%)和NSMF-ICSI(80.7%)組的正常受精率高于IVF組(70.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步對3組數(shù)據(jù)進行兩兩比較，SMF-ICSI組的正常受精率顯著高于IVF組，P=0.01<0.016 7。3組之間的1PN率、MPN率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、每周期妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IVF組卵子的自然退化率為1.4%；SMF-ICSI組和NSMF-ICSI組由機械損傷造成的卵子退化率分別為4.7%和3.5%, ICSI操作造成的卵子退化率更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步對3組數(shù)據(jù)進行兩兩比較，各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.016 7)。

另外，3組中新鮮移植周期加冷凍周期例數(shù)分別為IVF：48+48個周期、SMF-ICSI：8+16個周期、NSMF-ICSI：6+3個周期。IVF組的每周期臨床妊娠率為19.8%，SMF-ICSI為12.5%,NSMF-ICSI為11.1%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局 %

3 討論

ICSI的運用使其獲得正常受精卵是體外授精成功的關鍵。一般體外授精方式有常規(guī)IVF和ICSI兩種。ICSI主要用于男性因素的不孕癥，但在國外也運用于非男方因素的不孕癥。在朱家紅等[11]的研究中指出高齡非男性因素不孕患者治療周期中，ICSI不能改善胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局。Kim等[7]的研究認為，ICSI能提高反復種植失敗的非男性因素不孕患者的正常受精率和胚胎質(zhì)量，但最終不能改變低臨床妊娠率的結(jié)局。該研究的學者認為可能與患者的反復種植失敗、子宮內(nèi)膜容受性、女方年齡大、胚胎移植時間的選擇等復雜因素相關。

由于擔心獲卵數(shù)極少時進行常規(guī)IVF，可能會受精失敗或者多精受精，導致珍貴卵子不能形成可利用胚胎，有中心傾向于選擇ICSI以提高受精的比例和卵子利用率。在使用ICSI時，需考慮以下幾個因素：(1)顯微操作的干預，可能造成卵子退化；(2)卵子可能在操作時并未處于最佳成熟狀態(tài)，而過夜的常規(guī)IVF中卵子在體外成熟后更能通過自然選擇而獲得高質(zhì)量的受精卵；(3)ICSI跨越自然受精的全部障礙，可能存在安全隱患，如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)的使用，可能會對卵子和胚胎造成負面影響[12]，但目前關于對子代安全方面的研究中，無論哪種授精方式，子代的出生缺陷[13]和精神運動發(fā)育[14]都相似的結(jié)果；(4)相對于IVF技術，進行ICSI技術所需要的人力、物力和經(jīng)費更多。在我們的研究中ICSI組沒有降低卵子的多精受精率，3組的多精受精率差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)；ICSI組中的卵子退化率更高，3組的卵子退化率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，在極少卵的患者中應用ICSI技術時應權衡利弊和個體原因，慎重選擇。

僅獲得單個卵子周期的研究中，Gozlan和Ioannis等[15-16]先后報道通過ICSI不能提高非男性因素不育患者的受精率和胚胎質(zhì)量。郭新宇等[17]的研究也表明無明確男性因素的卵巢低反應周期，行ICSI治療并未提高其受精率。另外，有研究認為胚胎的質(zhì)量最主要取決于配子本身的內(nèi)在因素，與授精方式無關[18]。本研究也表明ICSI能提高嚴重男性因素和非嚴重男性因素的正常受精率，但不能提高胚胎利用率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，不能改善低臨床妊娠率的結(jié)局。這可能與女方年齡較大、卵子的質(zhì)量較差、子宮內(nèi)膜容受性差等因素相關。因此支持單個卵的授精方式仍應由是否有男方因素來決定的觀點。

本研究中，NSMF-ICSI組進行ICSI的原因分析如下： NSMF-ICSI組(男方精液無明顯異?；騼H有一項參數(shù)稍弱)的63個周期中，前一周期IVF完全受精失敗有26個周期(41.3%)，前次IVF受精率低于30%有5個周期(7.9%)，異常受精 4個周期(6.3%)，故本周期改用ICSI授精。剩余28個周期(44.4%)均為精液參數(shù)有一項或多項異常，未達到嚴重少弱精標準，但由于精液處理后回收量極低，處理后的精液密度<1×106·mL-1，未達IVF標準。常規(guī)IVF周期引起完全受精失敗與低受精率的因素包括精子與卵子的質(zhì)量，受精過程及體外環(huán)境等，目前尚無明確方法預防受精失敗的發(fā)生，因此在NSMF-ICSI組中前一周期完全受精失敗或低受精率共31個周期(占49.2%)，是導致該組總周期數(shù)高于其它兩組的最主要原因。

本研究中ICSI組的多精受精率與IVF組比較，差異無統(tǒng)計學意義。大多數(shù)的報道研究認為：常規(guī)IVF多PN率為5%～8.1%，ICSI是2.5%～6.2%，在本研究中IVF多PN率為14.2%，高于大多文獻報道。多精受精的原因可能與卵子的成熟度、授精精子密度、皮質(zhì)反應、卵子募集過程中造成的透明帶損傷或先天透明帶缺陷、卵泡液中高激素水平相關，少量患者的某些周期中可見高比例的多原核合子。我們的研究中3組的年齡均為38歲以上，均為高齡女性，卵子過熟或不熟可能是其主要原因。 ICSI周期的MPN率分別為18.6%、12.3%，并沒有降低多精受精率，其原因可能包括：首先，卵母細胞第二極體未能排出或排出“假第二極體”(不含遺傳物質(zhì))致使形成兩個雌原核；其次，注入二倍體的精子；再次，卵子本身為多倍體異常，高齡婦女卵母細胞內(nèi)線粒體長度變短和端粒酶活性下降影響同源染色體聯(lián)會、減數(shù)分裂最后導致卵母細胞非整倍體率相應增加，引起多倍體胚胎發(fā)生率增高；最后，ICSI的操作時可能損傷了赤道板區(qū)域引起染色體不能正常分離而出現(xiàn)多PN受精。

綜上所述，通過ICSI授精方式能提高嚴重男性因素和非嚴重男性因素的單個卵子的正常受精率，但不能降低多精受精率，也不能提高可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，并且不能改善低周期臨床妊娠率的結(jié)局。因此，此類患者選擇哪種授精方式應根據(jù)男方精液質(zhì)量結(jié)合臨床的不孕史進行授精方式的選擇。由于本研究的樣本量少，尚需要多中心多樣本前瞻隨機對照研究來追蹤目前所證實的結(jié)果。