韓月丹 毛培江 業(yè) 康 金 捷 黃晶晶 欒會玲 金祖漢 王志安

1 杭州市第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 310006

2 浙江省中藥研究所有限公司 浙江 杭州 310023

本研究以有毒藥材姜半夏為例，小鼠AML12肝細(xì)胞為研究載體，比較同批次藥材來源的姜半夏配方顆粒與其傳統(tǒng)飲片煎劑相同生藥濃度下的毒性差異，為配方顆粒有效性、安全性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等研究提供實驗研究依據(jù)，為配方顆粒的臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 實驗樣品：姜半夏配方顆粒（批號：K1704059）：稱取姜半夏配方顆粒2g（每克配方顆粒相當(dāng)于12g生藥），研缽內(nèi)加蒸餾水研磨成細(xì)粉后，加純水稀釋定容至100ml，得濃度為0.24g生藥/ml藥液（240g生藥/L），臨用時用完全培養(yǎng)基稀釋成濃度為48g生藥/L的母液。姜半夏飲片煎劑（批號：17042106)：稱取240g中藥飲片放于煎藥罐中，煎煮兩次，合并濾液，55℃恒溫烘干后粉碎，得69.8g干粉，相當(dāng)于3.44g生藥/g干粉。稱取6.98g干粉，純水稀釋定容至100ml，得濃度為0.24g生藥/ml藥液（240g生藥/L），臨用時用完全培養(yǎng)基稀釋成濃度為48g生藥/L的母液。樣品均由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑 ：DMEM/F12（1∶1)培 養(yǎng)液（GIBCO，批號8118043）；胎牛血清（四季青，批號20170315）；胰蛋白酶-EDTA（GENVIEW，批號 711160101100）；雙抗（GEN‐VIEW，批號84020101100）；四甲基偶氮唑藍(lán)（Amresco）；二甲基亞砜（Amresco，批號1077C109）；Hoechst33258熒光染液（碧云天，批號032318180417）；抗熒光猝滅封片液（碧云天，批號030218180319）。

1.3 實驗儀器設(shè)備：精密天平（BS110S，北京賽多利斯天平公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（M200，TECAN）；二氧化碳孵育溫箱（NU 5810E，NUAIRE）；超凈臺（SW-CJ-IF，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（DM 4000，Leica）；光學(xué)顯微鏡（XSZ-D2，重慶光學(xué)儀器廠）。

1.4 細(xì)胞：小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞株AML12，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：AML12肝細(xì)胞用含10% FBS，1%青-鏈霉素的DMEM/F12（1∶1)完全培養(yǎng)液（含1ml ITS Liquid Media Supplement/100ml、40ng地塞米松/100ml）培養(yǎng)，置37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，飽和濕度下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。觀察其培養(yǎng)液的顏色變化與細(xì)胞生長情況，及時換液，細(xì)胞長至對數(shù)生長期時用于實驗。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力：每塊96孔板設(shè)6個空白孔，給藥組分別加入不同濃度（母液組以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液濃度組）的姜半夏配方顆粒與飲片煎劑藥液，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔200μl，暴露48h后，用多功能酶標(biāo)儀檢測490nm處各孔A值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（A給藥組-A空白）/（A對照組-A空白）×100%。

2.3 Hoechst33258染色法檢測細(xì)胞核形態(tài)：以每毫升5×104個細(xì)胞接種至六孔板，每孔2ml，分別加入1/20和1/100母液濃度（母液濃度為48g生藥/L）的姜半夏中藥配方顆粒與其飲片煎劑，設(shè)不加藥物的對照組，暴露48h后，每孔加入0.5ml 4%多聚甲醛固定后棄去固定液，每孔加入0.5ml Hoechst33258染液，染色5min，滴一滴抗熒光猝滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，在激發(fā)波長360nm處用顯微鏡觀察并拍照，進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)觀察，并使用Image J軟件進(jìn)行熒光強度半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑對AML12肝細(xì)胞活力的影響：姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑作用AML12肝細(xì)胞48h后，配方顆粒母液組以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液濃度組的細(xì)胞存活率分別為（140.47±10.45）%、（130.58±13.34）%、（119.72± 12.36）%、（104.71± 6.55）%、（104.43±5.75）% 、（101.60 ± 6.65）% 、（103.21 ± 9.93）% 、（100.32±6.38）%；飲片煎劑母液組以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液濃度組細(xì)胞存 活 率 為（145.23± 14.86）%、（126.79±4.87）%、（112.88±3.97）%、（91.79±3.09）%、（91.09±6.74）%、（94.95±5.25）%、（94.62±4.93）%、（93.28±4.11）%（結(jié)果見圖1）。結(jié)果表明，暴露48h后，姜半夏配方顆粒（1/20-1）濃度組和姜半夏飲片煎劑（1/20-1）濃度組隨著濃度的增加，增強了細(xì)胞的活力，但濃度為1/20與1/100時兩組間具有極顯著性差異，其中飲片煎劑組出現(xiàn)了細(xì)胞抑制的情況。

圖1 48h不同濃度姜半夏配方顆粒與飲片煎劑對AML12細(xì)胞存活率的影響（n=6)

3.2 姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑對AML12肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響：根據(jù)MTT的實驗結(jié)果，選擇1/20和1/100母液濃度（母液濃度為48g生藥/L）的姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑進(jìn)行熒光染色對比實驗。姜半夏配方顆粒組與其飲片煎劑組作用于AML12肝細(xì)胞48h后，均出現(xiàn)不同程度細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)濃縮、部分破裂等凋亡現(xiàn)象，其熒光強度逐漸增強；相同劑量下比較，姜半夏配方顆粒組細(xì)胞核固縮凋亡情況較飲片煎劑組少（結(jié)果見圖2）。熒光半定量結(jié)果同樣顯示在藥品母液濃度的1/20與1/100時，姜半夏配方顆粒組細(xì)胞凋亡的較其飲片煎劑組少（結(jié)果見圖3）。結(jié)果表明，姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑組均對AML12肝細(xì)胞有一定的損傷；在相同濃度下，姜半夏配方顆粒對細(xì)胞的損傷較其飲片煎劑小。

4 討論

圖2 熒光顯微鏡觀察姜半夏配方顆粒與飲片煎劑處理AML12細(xì)胞48 h后Hoechst33258染色細(xì)胞核形態(tài)（標(biāo)尺：100μm）

圖3 熒光強度半定量分析結(jié)果

目前，中藥配方顆粒在美國、日本等國家發(fā)展極快，除滿足本國外還大量出口。我國對中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)也開始重視和大力推動，把中藥配方顆粒納入國家中醫(yī)藥方面發(fā)展的重要內(nèi)容之一。對于中藥配方顆粒與其飲片煎劑特別是有些毒性藥材、復(fù)方等的有效性、安全性是否一致，學(xué)術(shù)界尚一直存有爭論。

本實驗在細(xì)胞水平，對有毒中藥姜半夏配方顆粒與其傳統(tǒng)煎劑的毒性進(jìn)行了初步的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，生姜與生半夏同用可以顯著減少生半夏對小鼠腹腔的刺激性。而在藥物細(xì)胞毒性的早期研究過程中，通過體外肝細(xì)胞作為通用的肝毒性體外試驗工具，常對藥物的早期安全性進(jìn)行評價。根據(jù)細(xì)胞活力實驗結(jié)果表明，藥物濃度為母液濃度1/20與1/100時，兩組間具有極顯著性差異，其中姜半夏飲片煎劑組出現(xiàn)了細(xì)胞抑制情況。熒光實驗中，AML12肝細(xì)胞在姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑作用48h后，與對照組比較均出現(xiàn)不同程度細(xì)胞核固縮，其熒光強度逐漸增強。熒光半定量結(jié)果顯示在相同劑量下，姜半夏飲片煎劑使熒光更強，證明其細(xì)胞核固縮更顯著，細(xì)胞凋亡更明顯，因此說明姜半夏配方顆粒對小鼠AML12肝細(xì)胞毒性小于姜半夏飲片煎劑。具體原因有待后續(xù)結(jié)合成分分析等更深入的研究來驗證。

本研究探索性地使用細(xì)胞毒性評價的方法對比姜半夏飲片煎劑與其所制成中藥配方顆粒的毒性差異，實驗結(jié)果表明，在相同生藥濃度下，中藥配方顆粒毒性小于其飲片煎劑。